α−シヌクレインキナーゼ

专利摘要:
患者の脳のレヴィー小体病（ＬＢＤ）と関係がある疾患の処置のための薬剤および方法が提供される。好ましい薬剤としては、ＰＬＫ２キナーゼの阻害剤が挙げられる。１つの態様では、本発明により、レヴィー小体病（ＬＢＤ）を処置するための活性について薬剤をスクリーニングする方法が提供される。そのような疾患としては、パーキンソン病（ＰＤ）、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレヴィー体変異体（ＬＢＶ）、複合型のＰＤおよびアルツハイマー病（ＡＤ）、ならびに、多系統委縮症（ＭＳＡ）として同定された症候群が挙げられる。
公开号:JP2011515072A
申请号:JP2010546937
申请日:2009-02-13
公开日:2011-05-19
发明作者:ジョン；ピー． アンダーソン，；ケリー イングリス，；アイリーン グリスウォルド−プレナー，；ジェイソン ゴールドステイン，；デイビッド シェロー，；タミー；ジェイ． チルコート，；グリクバル；エス． バシ，；ノルマンド；エル．；ジュニア フリゴン，
申请人:エラン ファーマ インターナショナル リミテッド；
IPC主号:C12Q1-48

专利说明:

[0001] 関連出願
この出願は、２００８年２月１３日に出願された米国特許出願第１２／０３０，８４９号および２００８年５月１５日に出願された米国仮出願第６１／０５３，６３２号（これらの全体の内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。]
背景技術

[0002] レヴィー小体病（ＬＢＤ）は、ドーパミン作動系の変性、運動変化、認識機能障害、およびレヴィー小体（ＬＢ）の形成を特徴とする（非特許文献１）。ＬＢＤには、パーキンソン病、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレヴィー体変異体（ＬＢＶ）、複合型のパーキンソン病（ＰＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）（ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＡＤ））、ならびに多系統委縮症（ＭＳＡ）として同定された症候群が含まれる。レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）は、ＬＢＤの専門用語の相違にうまく折り合いをつけるために考え出された用語である。ＬＢを伴う障害は、老人個体群における運動性障害や認知鈍化の一般的な原因であり続けている（非特許文献２）。それらの発生率は増加し続けており、重大な公衆衛生的問題を発生しているが、現在までのところ、これらの障害について承認されている処置方法はない（非特許文献３）。ＬＢＤの原因については議論のあるところであり、そして様々な神経毒や遺伝的感受性因子を含む複数の要因が役割を果たしていると言われている。]
[0003] 近年、ＬＢＤの病因を理解したいという新たな望みが生じた。具体的には、いくつかの研究により、シナプスタンパク質であるα−シヌクレインが、ＰＤの病因において中心的な役割を果たしていることが示された。その理由は：（１）このタンパク質がＬＢ中に蓄積するため（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、（２）α−シヌクレイン遺伝子の変異がパーキンソニズムの珍しい家族性形態とともに分離するため（非特許文献７；非特許文献８）、そして（３）トランスジェニックマウス（非特許文献９）およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（非特許文献１０）におけるα−シヌクレインの過剰発現が、ＰＤのいくつかの病理学的側面を模倣しているためである。]
[0004] 多くの科学者らは、ＰＤは、全身性シヌクレイン病において比較的後期に発症し、そして「パーキンソニズムは氷山の一角にすぎない」と考えている（Ｌａｎｇｓｔｏｎ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００６）５９：５９１−５９６）。例えば、レヴィー小体は、交感神経節において、そして腸の筋層間神経叢において記載されている（Ｈｅｒｚｏｇ Ｅ．，Ｄｔｃｈ Ｚ Ｎｅｒｖｅｎｈｅｉｌｋ（１９２８）１０７：７５−８０；Ｋｕｐｓｋｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９８７）３７：１２５３−１２５５）。様々な障害が、レヴィー小体の存在に関係している。例えば、レヴィー小体は、レム睡眠行動障害の患者の脳幹の中で見られている（Ｕｃｈｉｙａｍａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９５）４５：７０９−７１２）。嗅覚機能障害は、パーキンソニズムの発症のかなり前から、多くのＰＤ患者において報告されている。偶発的レヴィー小体病（ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ）の患者と典型的なＰＤの患者に由来する心臓組織の試験により、心筋のシヌクレイン陽性神経炎が明らかにされた（Ｉｗａｎａｇａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９９）５２：１２６９−１２７１）。食道、下部の腸、および膀胱の機能障害が、末梢自律神経系のＰＤと関係がある病状の初期の徴候であることもまた明らかである（Ｑｕａｌｍａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９８４）８７：８４８−８５６；Ｃａｓｔｅｌｌら、Ｎｅｕｒｏｇａｓｄｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｍｏｔｉｌ（２００１）１３：３６１−３６４；Ｈａｇｕｅら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）（１９９７）９４：１９２−１９６）。したがって、脳および他の組織の中でのα−シヌクレインの蓄積が、ヒト、マウス、およびハエといった多様な種において、類似する形態学的および神経学的変化と関係があるという事実は、この分子がＰＤの発症に寄与していることを示唆している。]
先行技術

[0005] ＭｃＫｅｉｔｈら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４
Ｇａｌａｓｋｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）５１：８８８−９５
Ｔａｎｎｅｒら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）１３：４２７−３０
Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９−４０
Ｔａｋｅｄａら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２．３６７−７２
Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５−８
Ｋｒｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６−８
Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５−７
Ｍａｓｌｉａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１２６５−９
Ｆｅａｎｙら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：３９４−８]
課題を解決するための手段

[0006] １つの態様では、本発明により、レヴィー小体病（ＬＢＤ）を処置するための活性について薬剤をスクリーニングする方法が提供される。そのような疾患としては、パーキンソン病（ＰＤ）、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレヴィー体変異体（ＬＢＶ）、複合型のＰＤおよびアルツハイマー病（ＡＤ）、ならびに、多系統委縮症（ＭＳＡ）として同定された症候群が挙げられる。いくつかの方法により、表１Ａ、Ｂ；Ｃ、表２、表１１、または表１２に示されるキナーゼの活性もしくは発現を調節する薬剤を同定すること、ならびに、その薬剤が、疾患の動物モデルにおいてＬＢＤの処置に有用な活性を示すかどうかを決定することを含む。いくつかの方法では、調節は阻害である。いくつかの方法では、工程（ａ）には、その薬剤がキナーゼを阻害するかどうかを同定することが含まれる。いくつかの方法では、工程（ａ）は、キナーゼおよび／またはα−シヌクレインを発現する核酸で形質転換された細胞の中で行われる。いくつかの方法では、工程（ａ）はインビトロで行われる。いくつかの方法では、工程（ｂ）は、ＬＢＤ疾患のトランスジェニック動物モデルの中で行われ、トランスジェニック動物は、ヒトのα−シヌクレインを発現するトランスジーンを持ち得る。好ましくは、キナーゼは、ＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、ＧＡＫ、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、およびＭＥＴのうちの少なくとも１つであり、そして調節は阻害である。キナーゼがＰＬＫ２またはＧＲＫ６であり、調節が阻害であることがさらに好ましい。キナーゼがＰＬＫ２であることがさらに好ましい。好ましくは、いくつかの方法では、キナーゼがＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、またはＧＡＫであり、そして調節は活性化である。いくつかの態様では、工程（ｂ）には、トランスジェニック動物を薬剤と接触させること、そしてその薬剤が、その薬剤で処置されていない対照のトランスジェニック動物と比較して、α−シヌクレインの沈着の形成を阻害するかどうかを決定することが含まれる。]
[0007] 別の態様では、本発明により、ＬＢＤの処置または予防をもたらす方法が提供される。この方法のいくつかの例には、この疾患に罹患しているか、またはこの疾患のリスクがある患者に対して、キナーゼの活性または発現を調節するために有効な薬剤の有効なレジュメを投与する工程が含まれる。キナーゼは、表１Ａ、Ｂ、もしくはＣ、表２、表１１、または表１２に示されているもののうちの１つであり得る。好ましくは、薬剤は、キナーゼに対する抗体、キナーゼの発現を調節する亜鉛フィンガータンパク質、または、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、またはキナーゼの核酸配列に相補的な配列を有しているＲＮＡである。いくつかの方法では、調節は阻害であり、好ましくは、キナーゼは、以下の少なくとも１つである：ＡＰＥＧ１、ＰＬＫ２、ＣＤＣ７Ｌ１、ＲＨＯＫ、ＡＤＲＢＫ１、ＡＤＲＢＫ２、ＧＲＫ２Ｌ、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、ＧＲＫ７、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、およびＭＥＴ。さらに好ましくは、キナーゼは、ＰＬＫ２またはＧＲＫ６である。さらに好ましくは、キナーゼはＰＬＫ２である。これらの方法のいくつかにおいては、キナーゼは、ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、およびＧＡＫの少なくとも１つであり、調節は活性化である。]
[0008] １つの態様では、本発明により、ＰＬＫ２活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与することによる、パーキンソン病と診断された患者を処置する方法が提供される。１つの実施形態では、薬剤は、ＰＬＫ１活性および／またはＰＬＫ３活性および／またはＰＬＫ４活性の阻害と比較して、ＰＬＫ２活性を優先的に阻害する。この薬剤は、例えば、ｓｉＲＮＡであり得る。１つの実施形態では、患者は、ガンと診断されていないかもしくはガンについて処置されていない、および／またはアルツハイマー病と診断されていないかもしくはアルツハイマー病について処置されていない。]
[0009] 関連する態様では、本発明により、シヌクレインのリン酸化が減少するように、細胞中でｐｏｌｏ様キナーゼ２（ＰＬＫ２）の活性を低下させることによって哺乳動物細胞中でのα−シヌクレインのリン酸化を阻害するための方法が提供される。関連する態様では、本発明により、α−シヌクレインのリン酸化が減少するように、細胞を細胞中のＰＬＫ２活性を低下させる化合物と接触させることによる、哺乳動物細胞（例えば、神経細胞）中でのα−シヌクレインのリン酸化を阻害するための方法が提供される。例えば、薬剤は、ＰＬＫ２遺伝子産物の発現を低下させ得る。]
[0010] 特定の実施形態では、薬剤は、ＰＬＫ１活性、ＰＬＫ２活性、またはＰＬＫ３活性の低下と比較して、ＰＬＫ２活性を優先的に低下させる。特定の実施形態では、薬剤は、４０００未満の分子量を持つ。１つの実施形態では、薬剤は合成化合物である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＰＬＫ２ＲＮＡ転写物の発現または翻訳を阻害するポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域の一方の鎖はＰＬＫ２転写物に完全に相補的であるが、ＰＬＫ１転写物またはＰＬＫ３転写物には相補的ではない。]
[0011] 別の態様では、本発明により、α−シヌクレインを発現する細胞を、その遺伝子に特異的に結合するキナーゼまたは亜鉛フィンガータンパク質をコードする遺伝子に相補的な配列を有している核酸でトランスフェクトすることによる、α−シヌクレインをリン酸化するキナーゼを同定する方法が提供される。トランスフェクトされた核酸または亜鉛フィンガータンパク質は、キナーゼの発現を阻害する。そしてその後、細胞中のリン酸化されたα−シヌクレインの量を、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする核酸でトランスフェクトされていない対照細胞と比較して測定することができる。この場合、リン酸化されたα−シヌクレインの減少により、このキナーゼがα−シヌクレインをリン酸化することの指標が提供されるであろう。いくつかの方法にはまた、核酸でトランスフェクトされていない対照細胞と比較して、細胞によって生産されたα−シヌクレインの量を測定する工程も含まれる。いくつかの方法では、核酸は、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子である。]
[0012] 本発明により、α−シヌクレインを発現する哺乳動物細胞中でのα−シヌクレインのリン酸化を減少させる薬剤を同定する方法が提供される。この方法には、ａ）ＰＬＫ２を発現する（および状況に応じてシヌクレインを発現する）細胞中でのＰＬＫ２の活性を低下させる、そしてｂ）ＰＬＫ１を発現する細胞中でのＰＬＫ１の活性を低下させないか、またはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ１の活性を低下させる；ならびに／あるいは、ｃ）ＰＬＫ３を発現する細胞中でのＰＬＫ３の活性を低下させないか、またはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ３の活性を低下させる；ならびに／あるいは、ｄ）ＰＬＫ４を発現する細胞中でのＰＬＫ４の活性を低下させないか、またはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ４の活性を低下させる薬剤を選択する工程が含まれる。細胞は、α−シヌクレインを過剰発現する哺乳動物細胞であり得る。１つの実施形態では、薬剤は、ａ）ＰＬＫ２を発現する細胞中でのＰＬＫ２の活性を低下させ；ｂ）ＰＬＫ１を発現する細胞中でのＰＬＫ１の活性を低下させないか、またはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ１の活性を低下させ；ｃ）ＰＬＫ３を発現する細胞中でのＰＬＫ３の活性を低下させないか、またはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ３の活性を低下させ；そして、ｄ）ＰＬＫ４を発現する細胞中でのＰＬＫ４の活性を低下させないか、またはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ４の活性を低下させる。さらなる工程においては、この方法には、選択された薬剤が、その疾患の動物モデルまたはその疾患の細胞モデルにおいてレヴィー小体病の処置に有用な活性を示すかどうかを決定する工程が含まれる。動物モデルにはトランスジェニック動物が含まれる。細胞モデルには、神経系統に由来する細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ）培養物と、α−シヌクレインを過剰発現する哺乳動物細胞が含まれる。アッセイすることができる活性としては、セリン−１２９でリン酸化された全α−シヌクレインの割合の低下、または細胞中のα−シヌクレインの凝集の減少が挙げられる。]
[0013] 他の態様では、本発明により、シンフィリンの活性または発現を調節する薬剤を同定すること、そしてその薬剤がその疾患の動物モデルにおいてＬＢＤの処置に有用な活性を示すかどうかを決定することによる、レヴィー小体病（ＬＢＤ）を処置するための活性について薬剤をスクリーニングする方法が提供される。]
[0014] 他の態様では、本発明により、Ｓｅｒ−１２９がリン酸化されたα−シヌクレインを生産するための方法が提供される。この方法は、α−シヌクレインをコードするプラスミドおよびＰＬＫ２をコードするプラスミドが細菌細胞の中に提供され、α−シヌクレインとＰＬＫ２とが生産されて、その結果、ＰＬＫ２が細菌細胞の中でα−シヌクレインをリン酸化するように、これらのプラスミドが同時発現されるように細胞を培養すること、そして、細胞からリン酸化されたα−シヌクレインを単離することによる。]
図面の簡単な説明

[0015] 図１Ａ〜Ｃは、様々な組み換え体キナーゼによるα−シヌクレインのリン酸化についてのインビトロでのリン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａは全α−シヌクレインを示し、図１Ｂは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−セリン−１２９）のリン酸化を示し、そして図１Ｃは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７（ホスホ−セリン−８７）のリン酸化を示す。
図１Ａ〜Ｃは、様々な組み換え体キナーゼによるα−シヌクレインのリン酸化についてのインビトロでのリン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａは全α−シヌクレインを示し、図１Ｂは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−セリン−１２９）のリン酸化を示し、そして図１Ｃは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７（ホスホ−セリン−８７）のリン酸化を示す。
図１Ａ〜Ｃは、様々な組み換え体キナーゼによるα−シヌクレインのリン酸化についてのインビトロでのリン酸化アッセイの結果を示す。図１Ａは全α−シヌクレインを示し、図１Ｂは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９（ホスホ−セリン−１２９）のリン酸化を示し、そして図１Ｃは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７（ホスホ−セリン−８７）のリン酸化を示す。
図１Ｄ〜Ｆは、ＧＰＣＲ−受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリー由来のキナーゼおよびＰＬＫ２を含む、組み換え体キナーゼを用いた実験を示す。図１Ｄは、全α−シヌクレインを示し、図１Ｅは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、そして図１Ｆは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
図１Ｄ〜Ｆは、ＧＰＣＲ−受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリー由来のキナーゼおよびＰＬＫ２を含む、組み換え体キナーゼを用いた実験を示す。図１Ｄは、全α−シヌクレインを示し、図１Ｅは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、そして図１Ｆは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
図１Ｄ〜Ｆは、ＧＰＣＲ−受容体キナーゼ（ＧＲＫ）ファミリー由来のキナーゼおよびＰＬＫ２を含む、組み換え体キナーゼを用いた実験を示す。図１Ｄは、全α−シヌクレインを示し、図１Ｅは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−１２９のリン酸化を示し、そして図１Ｆは、α−シヌクレインのｐｓｅｒ−８７のリン酸化を示す。
図２ＡおよびＢは、様々なキナーゼについてのインビトロでのキナーゼ活性の結果を示す。図２Ａは、全（ＡＳ）を示す。図２Ｂは、ホスホル−セリン１２９（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｓｅｒｉｎｅ １２９）を示す。
図３Ａ〜Ｃは、様々なキナーゼについてのインビトロでのキナーゼ活性の結果を示す。図２Ａは、全ＡＳを示す。図３Ｂは、セリン１２９を示す。図３Ｃは、ホスホ−セリン８７を示す。
図３Ａ〜Ｃは、様々なキナーゼについてのインビトロでのキナーゼ活性の結果を示す。図２Ａは、全ＡＳを示す。図３Ｂは、セリン１２９を示す。図３Ｃは、ホスホ−セリン８７を示す。
図３Ａ〜Ｃは、様々なキナーゼについてのインビトロでのキナーゼ活性の結果を示す。図２Ａは、全ＡＳを示す。図３Ｂは、セリン１２９を示す。図３Ｃは、ホスホ−セリン８７を示す。
図４ＡおよびＢは、図３Ａおよび３Ｂのアッセイ結果に対するリン脂質の影響を示す。図４Ａは、全ＡＳを示す。図４Ｂは、セリン１２９を示す。
図５は、２９３−シヌクレイン細胞へのＰＬＫ２に対するｃＤＮＡのトランスフェクションの結果を示す。細胞を、全シヌクレインレベルおよびホスホ−シヌクレインレベルについてＥＬＩＳＡによって分析した。
図６は、ＨＥＫ−シヌクレイン細胞へのＧＰＲＫ６およびＰＬＫ２に対するｃＤＮＡのトランスフェクションの結果を示す。
図７は、第２の供給源に由来するｓｉＲＮＡを使用したＰＬＫ２のノックダウンが、リン酸化されたα−シヌクレインの割合の低下を引き起こすことを示す。
図８Ａおよび８Ｂは、推定されるキナーゼによるインビトロでのα−シヌクレインのリン酸化がα−シヌクレインＫＯマウスの脳を標的化することを示す。
図９Ａおよび９Ｂは、推定されるキナーゼによるインビトロでのα−シヌクレインのリン酸化がα−シヌクレインＫＯマウスの脳を標的化することを示す。
図１０は、ＰＬＫ２のｓｉＲＮＡによるノックダウンが、α−シヌクレインのリン酸化を減少させるが、ＰＬＫ３またはＰＬＫ４のｓｉＲＮＡによるノックダウンによってはそうはならないことを示す。] 図１０ 図１Ａ 図１Ｂ 図１Ｃ 図１Ｄ 図１Ｅ 図１Ｆ 図２ 図２Ａ 図２Ｂ
[0016] Ｉ．定義
用語「薬剤」は、薬理学的活性を有しているか、または薬理学的活性を有している可能性がある化合物を記載するために使用される。薬剤には、既知の薬物である化合物、その薬理学的活性は同定されているが、さらなる治療的評価を受けている化合物、および薬理学的活性についてスクリーニングされるコレクションおよびライブラリーのメンバーである化合物が含まれる。]
[0017] 「薬理学的」活性は、薬剤が疾患の予防または処置に有用であるか、または有用である可能性があることを示すスクリーニングシステムにおいて、薬剤が活性を示すことを意味する。スクリーニングシステムは、インビトロ、細胞、動物、またはヒトであり得る。薬剤は、薬理学的活性を有しているとして記載することができるが、それにもかかわらず、疾患の処置における実際の予防的有用性または治療的有用性を確定するためには、さらなる試験が必要である場合がある。]
[0018] レヴィー様小体は、ヒト患者において見られるレヴィー小体の特徴の一部または全てに類似する、トランスジェニック動物において見られるα−シヌクレインの沈着である。好ましい特徴は、密集したα−シヌクレイン陽性封入体である。これらの封入体は、好ましくは、年齢依存性様式で形成する。α−シヌクレイン陽性封入体の形成によっては、好ましくは、観察することができる細胞病理学が生じ、罹患したニューロンの機能の喪失につながる。罹患したニューロンの機能の喪失は、行動試験、神経薬理学的反応の評価、および電気生理学によって決定することができる。]
[0019] 表現「特異的に結合する」は、タンパク質および他の生物製剤の不均質な集団の存在下での、そのタンパク質の存在を決定づける結合反応をいう。したがって、指定される条件下で、特定のリガンドは特定のタンパク質に優先的に結合し、そして試料中に存在する有意な量の他のタンパク質には結合しない。タンパク質に特異的に結合する抗体のような分子は、多くの場合、少なくとも１０６Ｍ−１または１０７Ｍ−１、好ましくは、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、そしてさらに好ましくは、約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１またはそれ以上の結合定数を有する。様々な免疫アッセイ形式を、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用されている。特異的免疫反応性を決定するために使用することができる免疫アッセイ形式と条件の例については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。]
[0020] 配列比較のためには、典型的には、１つの配列が参照配列とされ、これに対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが使用される場合は、試験配列と参照配列がコンピューターに入力され、続いて、必要に応じて座標が設定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが設定される。その後、配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対する試験配列（単数または複数）のパーセント配列同一性が、設定されたプログラムのパラメーターに基づいて計算される。]
[0021] 比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、あるいは、目視検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこと）によって、行うことができる。]
[0022] パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適しているアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手することができる。このアルゴリズムには、データベース配列の中の同じ長さのワードとアラインメントされた場合に、いくらかのポジティブに評価された閾値Ｔと適合するかまたはそれを満たすかのいずれかである、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に特定する工程が含まれる。Ｔは、周辺のワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（前出））。これらの最初の周辺ワードのヒットは、それらが含まれるより長いＨＳＰを見つけるための最初の検索のための種となる。このワードのヒットは、その後、累積アラインメントスコアを増大させることができる限りは、それぞれの配列に沿って両方の方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致している残基の対についての見返りスコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に、＞０）、およびＮ（一致していない残基についてのペナルティースコア；常に、＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。それぞれの方向のワードのヒットの伸張は、累積アラインメントスコアが、その最大に達した値から照会Ｘによって低下した場合；累積スコアが、１つ以上のネガティブにスコアされる残基のアラインメントの累積が原因で０またはそれ未満になった場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達した場合には、停止させられる。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲に含まれているかどうかを同定するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメーターが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較がデフォルトとして使用される。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスがデフォルトとして使用される。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列についてタンパク質配列が使用される）では、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスがデフォルトとして使用される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。]
[0023] パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってはまた、２つの配列間での類似性の統計分析を行うこともできる（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最少和可能性（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これによっては、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で一致が偶然に発生する可能性の目安が提供される。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最少和可能性が、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは、約０．００１未満である場合に、参照配列に対して類似であると考えられる。]
[0024] アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のためには、アミノ酸は以下のようにグループ分けされる：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の方向性に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換には、同じクラスのアミノ酸の間での置換が含まれる。非保存的置換は、これらのクラスうちの１つのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することである。]
[0025] 本発明の治療薬は、典型的には、望ましくない混入物質を含まない実質的に純粋なものである。このことは、薬剤が、典型的には、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であり、さらに、これには妨害性タンパク質および混入物質が実質的に含まれていないことを意味している。多くの場合、薬剤は、少なくとも約８０％ｗ／ｗであり、そしてより好ましくは、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％ｗ／ｗの純度である。しかし、従来のタンパク質精製技術を使用して、少なくとも９９％ｗ／ｗの均質なペプチドを得ることができる。]
[0026] 用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、完全な抗体およびその結合性断片が含まれるものとして使用される。典型的には、断片は、抗原断片に対する特異的結合のためにそれらが誘導された完全な抗体と競合し、これには別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖが含まれる。断片は、組換えＤＮＡ技術により生成されるか、または完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的分離により生成される。用語「抗体」にはまた、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に結合させられているか、または融合タンパク質として発現される、１つまたは複数の免疫グロブリン鎖も含まれる。用語「抗体」にはまた、二重特異性抗体が含まれる。二重特異性抗体または二官能性抗体は、２種類の異なる重鎖／軽鎖対を有しており、２種類の異なる結合部位を有している、人工的なハイブリッド抗体である。二重特異的抗体を、ハイブリドーマの融合または複数のＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって生成させることができる（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）。]
[0027] 障害の徴候は、正常な機能、感覚、または外観からの逸脱を示している障害を有している個体が経験する現象を意味する。]
[0028] 障害の徴候は、障害の存在またはリスクを示すために役立つ何らかの身体的徴候である。]
[0029] 用語「患者」には、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けているヒトおよびその他の哺乳動物被験体が含まれる。]
[0030] 本明細書中で使用される場合は、症状（例えば、パーキンソン病）または患者の「処置」は、有用な結果または所望される結果を得るための工程を行うことをいう。本発明の目的について、有用な結果または所望される結果としては、パーキンソン病の１つまたは複数の症状の緩和または軽減、病変の範囲の縮小、疾患の進行を遅らせるかまたは遅くすること、疾患状態の軽減、改善、または安定化が挙げられるが、これらに限定されない。]
[0031] 本明細書中で使用される場合は、薬物の「治療有効量」は、パーキンソン病と診断された被験体、またはパーキンソン病を発症するリスクがあると診断された被験体に投与された場合に、意図される治療効果（例えば、被験体における疾患の１つまたは複数の徴候の緩和、軽減、改善、あるいは排除）を有するであろう、薬物の量である。１用量の投与によって完全な治療効果が得られる必要は必ずしもなく、完全な治療効果は、一連の複数回の投与後にしか得られない場合もある。したがって、治療有効量は、１回または複数回の投与において投与され得る。]
[0032] １つまたは複数の記載された構成要素を「含む」組成物または方法には、具体的に記載されていない他の構成要素が含まれる場合がある。例えば、α−シヌクレインペプチドを含む組成物には、単離されたα−シヌクレインペプチドおよびより大型のポリペプチド配列の構成成分としてのα−シヌクレインペプチドの両方が含まれる。]
[0033] 文脈から明らかである場合を除き、本発明の個々の実施形態、構成要素、工程、または特徴は、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。]
[0034] ＩＩ．一般論
本発明は、レヴィー小体病（ＬＢＤ）を、α−シヌクレインをリン酸化し、そして／またはその生産を阻害する１種類または複数のキナーゼを阻害することによって阻害することができるという見識に一部基づく。本発明の実施は機構の理解には依存しないが、セリン−１２９でのα−シヌクレインのリン酸化は、α−シヌクレインの細胞内での沈着の形成をもたらす一連の分子事象の１つであると考えられる。ｓｅｒ−１２９でリン酸化されたα−シヌクレインは、びまん性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、多系統委縮症（ＭＳＡ）、およびパーキンソン病（ＰＤ）の家族性形態において、レヴィー小体（ＬＢ）の中に非常に多く存在する。ＬＢ中のホスホ−α−シヌクレインの異常な蓄積は、ホスホ−シヌクレインが、ＬＢの形成を導く病原性種であり得ること、ならびに、そのリン酸化を担うか、またはα−シヌクレイン自体の生産を調節するキナーゼ（単数または複数）が、複数のシヌクレイノパシーの処置のための治療標的（単数または複数）であることを示している。この一連の分子事象の他の事象には、おそらく、リン酸化後のタンパク質分解的切断が含まれる（２００４年５月１９日に出願されたＷＯ２００５／０１３８８９を参照のこと）。]
[0035] α−シヌクレインのリン酸化を主に担っているキナーゼ（単数または複数）の同定により、関連するキナーゼ（単数または複数）の活性を低下させる化合物を同定することが可能となる。便宜上、本明細書中での「α−シヌクレインのリン酸化」との言及は、セリン−１２９でのリン酸化をいう（しかし、別の場所、例えば、セリン−８７でのさらなるリン酸化が排除されるわけではない）。]
[0036] 本出願では、キナーゼ活性の低下に、α−シヌクレインのリン酸化の減少および／または全α−シヌクレインレベルの低下が付随する、いくつかのキナーゼの同定を報告する。特に、キナーゼＰＬＫ２は、α−シヌクレインのリン酸化を減少させるために阻害することができる。本発明により、（ｉ）これらのキナーゼの活性および発現の調節因子を同定する方法、（ｉｉ）キナーゼ阻害剤を使用してレヴィー小体病を処置する方法、および（ｉｉｉ）レヴィー小体病の処置に使用される例示的なキナーゼ阻害剤が提供される。]
[0037] 以下の実施例で議論されるように、本発明者らは、α−シヌクレインのリン酸化に重要なキナーゼを同定するために様々な実験を行った。セクションＩＩＩでは、α−シヌクレインキナーゼを同定するためのストラテジーを説明する。セクションＩＶでは、有望なα−シヌクレインキナーゼを同定するために使用したスクリーニングアッセイの結果をまとめる。セクションＶでは、シヌクレインキナーゼの活性または発現を低下させ、そして治療的に使用することができる薬剤を記載する。セクションＶＩでは、パーキンソン病および他のレヴィー小体病を処置するための方法を記載する。セクションＶＩＩではレヴィー小体病を記載する。セクションＶＩＩＩでは、レヴィー小体病のトランスジェニック動物モデルと細胞モデルを記載する。セクションＩＸでは、ＰＬＫ２および他のキナーゼの調節因子の同定のための方法を記載する。セクションＸでは、α−シヌクレインの単離のための方法を記載する。セクションＸＩでは、上記スクリーニングアッセイを含む実験結果を提供する。]
[0038] ＩＩＩ．標的キナーゼの同定
α−シヌクレインのリン酸化を直接または間接的に調節するキナーゼを、実施例に示すように同定することができる。一般的には、可能性のある阻害剤のライブラリーが、キナーゼ遺伝子のコレクションの既知の配列に基づいて設計される。ライブラリーのメンバーは、上記の分子のタイプのうちのいずれかであり得る。ライブラリーのメンバーは、その後、α−シヌクレインを発現する細胞に導入される。細胞とα−シヌクレインのいずれもがヒトのものであることが好ましい。通常は、そのような細胞は、ヒトのα−シヌクレインをコードするＤＮＡと、試験されるライブラリーのメンバーをコードするＤＮＡの両方でトランスフェクトされる。ライブラリーのメンバーは個別にスクリーニングすることができ、また、集団でスクリーニングすることもできる。ライブラリーのメンバーの導入と、そのライブラリーのメンバーが発現され、そのキナーゼの抑制を行うために十分な時間の培養の後、全α−シヌクレインレベルとリン酸化されたα−シヌクレインのレベルが測定され、キナーゼの発現を抑制するためのライブラリーのメンバーで処理されなかった別の同様の対照細胞中での対応するレベルと比較される。測定は、α−シヌクレインの全レベルを測定するためのα−シヌクレイン（好ましくは、ヒトのα−シヌクレイン）に特異的な抗体と、リン酸化されたα−シヌクレインのレベルを測定するためのリン酸化されたα−シヌクレインに特異的な抗体とを使用して、免疫アッセイによって行うことができる。例示的な抗体は、参考として本明細書に援用されるＷＯ０５０４７８６０に記載されている。測定誤差の典型的な範囲を超えるという意味で有意である、処理された細胞と対照細胞との間でのリン酸化されたα−シヌクレインのレベルの低下は、細胞に導入された阻害剤がキナーゼを阻害し、これが直接または間接的に、α−シヌクレインのリン酸化に影響を及ぼしたことを示している。キナーゼの同定は、阻害剤を個別にスクリーニングすることによって、または阻害剤が集団でスクリーニングされる場合には、阻害剤をコードする核酸を配列決定することによってのいずれかでの阻害剤の同定から決定することができる。同様に、そのようなレベルの測定における典型的な実験誤差の範囲を超える、処理された細胞と対照細胞との間でのα−シヌクレインの全レベルの低下は、その阻害剤が、α−シヌクレインの発現レベルに間接的に影響を与えるキナーゼを阻害することの指標を提供する。]
[0039] 最初のスクリーニングによって同定されたキナーゼ（特に、セリンキナーゼであることが公知のキナーゼ）は、その後、インビトロで、細胞中で、またはトランスジェニック動物モデルにおいて、α−シヌクレインをリン酸化するそれらの能力について試験することができる。インビトロでのアッセイは、キナーゼがα−シヌクレインを直接リン酸化するかどうか、したがって、α−シヌクレインを直接リン酸化することができると考えられる最初のスクリーニングにおいて同定されたキナーゼについてのみ有用であるかどうかの指標となる。細胞アッセイおよびトランスジェニックアッセイは、直接または間接的のいずれかでリン酸化に影響を及ぼすキナーゼをスクリーニングするために使用することができる。インビトロでのアッセイは、適切な緩衝液中で、α−シヌクレインを、試験されるキナーゼおよびＡＴＰと接触させることによって行われ得る。好ましくは、ＡＴＰはγ−３２Ｐ ＡＴＰであり、この場合、リン酸化されたα−シヌクレインは放射標識されるか、またはゲル上で検出することができる。リン酸化はまた、先に記載されたように、リン酸化されたα−シヌクレインに特異的な抗体を使用して測定することもできる。あるいは、リン酸化は、共役アッセイ（ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓｓａｙ）を使用してＡＴＰの消費を測定することによって間接的に測定することができる。ここでは、ＡＤＰは、例えば、Ｎａｔｕｒｅ ７８，６３２（１９５６）；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６，３１−４０（１９７０）に記載されているように検出される。リン酸化の程度は、キナーゼまたはＡＴＰ、あるいは両方が除外された対照と比較することができる。リン酸化の増加は、キナーゼがα−シヌクレインを直接リン酸化することの指標である。細胞アッセイは、α−シヌクレインを発現する細胞上で行われる。好ましくは、ヒトのα−シヌクレインが細胞にトランスフェクトされる。キナーゼを発現することができる核酸もまた、細胞にトランスフェクトされる。細胞中でのリン酸化されたα−シヌクレインのレベルは、キナーゼがトランスフェクトされていない同様の対照細胞中でのリン酸化されたα−シヌクレインのレベルと比較して測定される。リン酸化の増加は、キナーゼがα−シヌクレインを直接または間接的にリン酸化することの指標である。トランスジェニックアッセイは、レヴィー小体様の沈着を生じる傾向があるヒトのα−シヌクレインを発現するトランスジェニック動物を、キナーゼトランスジーンもまた発現する類似する動物と比較することによって行うことができる。α−シヌクレイントランスジーンだけを持つトランスジェニック動物と比較した、さらに別のキナーゼトランスジーンを持つトランスジェニック動物における、リン酸化されたα−シヌクレインおよび／またはレヴィー小体様の沈着の減少は、このキナーゼがα−シヌクレインのリン酸化に直接または間接的に関係があることの指標である。]
[0040] ＩＶ．標的キナーゼ
表１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、その阻害によってｓｅｒ−１２９位でのリン酸化を調節するタンパク質を示す。表１Ａは、セリンおよび／またはスレオニン残基を、そして場合によってはチロシンをリン酸化することができるキナーゼを示す。表１Ｂは、セリン残基を修飾することができない（知っている限りにおいて）チロシンキナーゼを示す。表１Ｃは、非タンパク質標的をリン酸化するが、タンパク質をリン酸化することは公知ではないキナーゼを示す。表１Ａの上の部分に由来するキナーゼは、α−シヌクレインのｓｅｒ−１２９の直接のリン酸化についての候補である。表１Ｂの上の部分に由来するキナーゼもまた、α−シヌクレインを間接的にリン酸化する役割を介して有用な治療標的である。表１Ｃの上の部分のタンパク質もまた、同じ理由から有用な治療標的である。各表の１列目、２列目、および３列目は、遺伝子の名称、キナーゼの名称、およびキナーゼのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を示す。次の列は、そのキナーゼに対するｓｉＲＮＡでの細胞の処理により、ｓｅｒ−１２９のリン酸化が減少する（「ダウン」）かまたは増大する（「アップ」）かを示している。次の３列は、測定したリン酸化レベルが３回の別々の実験の平均から逸脱している標準偏差の数値を示す。最後の２列は、キナーゼファミリー（すなわち、アミノ酸特異性）とグループを示す。]
[0041] 表２は、その阻害によってヒトのα−シヌクレインの全体的なレベルを調節するが、リン酸化の割合の変化を伴わないキナーゼを示す。表２は、ヒトのα−シヌクレインのレベルの最も大きな低下を伴うキナーゼを全て示す。列については、表１Ａ、１Ｂ、および１Ｃと同様に分類した。]
[0042] 表３および表４は、ヒトのα−シヌクレインの全体的なレベルを調節することが実施例において確証された、表１および表２によるキナーゼを示す。検証したこれらのキナーゼには、ＰＬＫ２、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＧＲＫ１、２、６、および７を、α−シヌクレインを直接または間接的にリン酸化するキナーゼとして含めた。阻害された場合に、α−シヌクレインのリン酸化を増加させることが明らかになったキナーゼＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、およびＧＡＫは、α−シヌクレインのリン酸化のネガティブな調節因子としておそらく機能する。インビトロでのリン酸化実験によるさらなるデータにより、インビトロでα−シヌクレインをリン酸化することができるとしてＰＫＬ２、ＧＲＫ２、５、６、および７が同定され、さらに、ＣＫＩＩおよびＩＫＢＫＢも同定された。細胞培養物中でのさらなる実験は、ＰＬＫ２とＧＰＲＫ６が、細胞培養物中でα−シヌクレインを直接リン酸化できることを示していた。これらのデータは、免疫組織化学によって裏付けられた。まとめると、ＰＬＫ２、およびそれほどではないにしてもＧＲＫ６が、レヴィー小体病における治療介入のための特に好ましい標的である。なぜなら、これらは、α−シヌクレインを直接リン酸化することができるからである。ＰＬＫ２およびＧＲＫ６を阻害する薬剤もまた、α−シヌクレインのリン酸化を阻害し、それにより、レヴィー小体病の処置または予防に使用することができる。]
[0043] 以下の実施例では、ｓｉＲＮＡでの細胞のトランスフェクションと特異的キナーゼ標的のノックダウンを、α−シヌクレインのリン酸化を直接または間接的に調節するキナーゼを同定するために使用した。その後のインビトロでおよび細胞培養物中での実験は、これらのキナーゼのうちの２つ、ＰＬＫ２が、α−シヌクレインのセリン１２９を直接、かつ特異的にリン酸化することを示していた。さらなる実験は、ＰＬＫ２が、α−シヌクレインのセリン１２９を、使用した実験条件下で、ＧＲＫ６および本明細書中に記載した他のキナーゼよりもはるかに大きい程度にリン酸化したことを示していた。したがって、ＰＬＫ２は、極めて有望なシヌクレインキナーゼである。ＰＬＫ２がシヌクレインキナーゼであることのさらなる証拠が実施例１１〜実施例１６で提供される。シヌクレインのリン酸化は、ＰＬＫ２に特異的なｓｉＲＮＡで処理された細胞の中では減少し、ＰＬＫ２活性についての複数の阻害剤が、初代神経培養物およびＰＬＫ２を過剰発現する細胞を含む様々な細胞のタイプの中でシヌクレインのリン酸化を減少させ、複数の阻害剤が、ＰＬＫ２に対するそれらの作用について観察されたＥＣ５０と一致するＥＣ５０で内因性のキナーゼに影響を及ぼす。]
[0044] ＰＬＫ２はＰｏｌｏ様キナーゼであり、これは、Ｇ１細胞周期タンパク質であり、細胞内での代謝回転が速く、シナプス可塑性に関係がある脳内で発現される。ＰＬＫファミリーのメンバーはセリン／スレオニンキナーゼであり、これには、Ｎ末端キナーゼドメインと、２つのｐｏｌｏボックスドメインからなる（ＰＬＫ１〜３）かまたは１つのｐｏｌｏボックスドメイン（ＰＬＫ４）からなるＣ末端調節ドメインとを持つ、４つのメンバーが含まれる。ｐｏｌｏボックスドメインは、足場タンパク質に結合するように作用し、これはその後、ＰＬＫを細胞内の特異的位置に対して標的化させ、そして、それらの標的タンパク質をリン酸化するように作用する（Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５）。ｐｏｌｏボックスはまた、キナーゼ活性を妨害する立体構造を採用することによって、キナーゼドメインをネガティブに調節するようにも作用する。ｐｏｌｏボックスが足場タンパク質に結合すると、ｐｏｌｏボックスは、キナーゼドメインから切り離され、その際に、キナーゼは活性な状態となり、その基質をリン酸化することができる。Ｐｏｌｏ様キナーゼは、Ｓｅｅｂｕｒｇら、２００５，「Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ」 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：２９２−８；Ｌｏｗｅｒｙら、２００５，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅｓ」 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：２４８−５９；およびＷｉｎｋｌｅｓら、２００５，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １，２，３，ａｎｄ ４ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ」 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：２６０−６に記載されている。ＤＮＡ配列とタンパク質配列は、以下の登録番号で見ることができる：]
[0045] ＰＬＫ２が活性化されると、これは、活性化されたニューロンの樹状突起に対して標的化させられる。ここで、ＰＬＫ２は、シナプス終末にあるタンパク質をリン酸化すると考えられている。ＰＬＫ２についての例示的な登録番号は表１Ａに提供される。ＰＬＫ２の配列は、Ｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３（１９），６９３６−６９４３（２００３），Ｂｕｒｎｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３（１６），５５５６−５５７１（２００３），Ｍａｔｓｕｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２（２１），３３０７−３３１８（２００３），Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９（２），４９１−４９８（２００１），Ｌｉｂｙら、ＤＮＡ ｓｅｑ．１１（６），５２７−５３３（２００１），Ｈｏｌｔｒｉｃｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（４２），４８３２−４８３９，Ｏｕｙａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（４４），６０２９−６０３６（１９９９）、およびＫａｕｓｅｌｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１８（２０），５５２８−５５３９のいずれか１つの中で見ることができる。ＰＬＫ２のアミノ酸配列または核酸配列との言及には、これらの参考文献のうちの任意のものの配列、またはそれらの対立遺伝子変異体が含まれる。ＰＬＫ２はＳＮＫとも呼ばれる。一貫性のために、名称ＰＬＫ２が本特許出願全体を通じて使用される。]
[0046] ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、およびＧＲＫ７もまた、レヴィー小体病における治療的介入の標的である。なぜなら、これらはおそらく、直接のキナーゼ（単数または複数）の間接的な活性化因子であるからである。したがって、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、およびＧＲＫ７を阻害する薬剤もまた、α−シヌクレインのリン酸化を阻害し、そしてレヴィー小体病の処置または予防のために使用することができる。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、およびＧＡＫは、α−シヌクレインのリン酸化のネガティブな調節因子である。したがって、これらのキナーゼを活性化させる薬剤は、α−シヌクレインのリン酸化を減少させ、レヴィー小体病の処置または予防に使用することができる。]
[0047] ＧＲＫ６はＧＰＲＫ６とも呼ばれ、これはＧタンパク質共役受容体キナーゼであり、シグナル伝達に関与している。Ｇタンパク質共役受容体キナーゼは、リガンドによって活性化されたＧタンパク質共役受容体をリン酸化し、脱感作させる。ＧＲＫ６の発現は、脳のほとんどの領域において、ＭＰＴＰ障害部で有意に上昇することがこれまでに示されている。一貫性のために、名称ＧＲＫ６が、本特許出願全体を通じて使用されるであろう。例示的な登録番号は表１Ａに提供される。ＧＲＫ６の配列は、以下のいずれかの中で見ることができる：Ｔｅｌｉら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ９８（２），３４３−３４８（２００３）；Ｍｉｙａｇａｗａら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３００（３），６６９−６７３（２００３）；Ｇａｕｄｒｅａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３５），３１５６７−３１５７６（２００２）；Ｇｒａｎｇｅ−Ｍｉｄｒｏｉｔら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１０１（１−２），３９−５１（２００２）；Ｗｉｌｌｅｔｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１８），１５５２３−１５５２９（２００２）；Ｂｌａｕｋａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４４），４０４３１−４０４４０（２００１）；Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９８（３），１２４３−１２５１（２００１）；Ｐｒｏｎｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（３４），２６５１５−２６５２２（２０００）；Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７（１３），７４４０−７４４５（２０００）；Ｐｒｅｍｏｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（４１），２９３８１−２９３８９（１９９９）；Ｂｒｅｎｎｉｎｋｍｅｉｊｅｒら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６２（３），４０１−４０８（１９９９）；Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４），２４３２８−２４３３４（１９９９）；Ｌａｚａｒｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３（６），８６６−８７８（１９９９）；Ｍｉｌｃｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５９（１），２２４−２２９（１９９９）；Ｐｒｅｍｏｎｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（２４），１４０８２−１４０８７（１９９８）；Ｓｔｏｆｆｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（４６），１６０５３−１６０５９（１９９８）；Ｌｏｕｄｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４３），２７４２２−２７４２７（１９９７）；Ｆｒｅｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２８），１７７３４−１７７４３（１９９７）；Ｂｕｌｌｒｉｃｈら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．７０（３−４），２５０−２５４（１９９５）；Ｓｔｏｆｆｅｌら、；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５），２７７９１−２７７９４（１９９４）；Ｌｏｕｄｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２６９１−２２６９７（１９９４）；Ｈａｒｉｂａｂｕ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２０），９３９８−９４０２（１９９３）；およびＢｅｎｏｖｉｃ ａｎｄ Ｇｏｍｅｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２６），１９５２１−１９５２７（１９９３）。ＧＲＫ６のアミノ酸配列または核酸配列との言及には、これらの参考文献のうちの任意のもののアミノ酸配列もしくは核酸配列、およびそれらの対立遺伝子変異体が含まれる。]
[0048] カゼインキナーゼ２（カゼインキナーゼＩＩ、ＣＫＩＩ、ＣＳＮＫ２、およびＣＳＮＫＩＩとも呼ばれる）は、α−シヌクレインをリン酸化することが報告されている。一貫性のために、名称ＣＫＩＩが本明細書中で使用されるであろう。ＣＫＩＩの配列は、以下の登録番号でＧｅｎｂａｎｋに提供されており：ＮＭ＿００１８９６、ＮＭ＿００１３２０、そして／または以下のうちの任意の１つの中で見ることができる：Ｐａｎａｓｙｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（４２），３１１８８−３１２０１（２００６）；Ｓａｌｖｉら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５８０（１６），３９４８−３９５２（２００６）；Ｌｉｍら、Ｃｅｌｌ １２５（４），８０１−８１４（２００６）；Ｌｌｏｒｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９４（Ｐｔ．１），２２７−２３６，（２００６）；Ｂｊｏｒｌｉｎｇ−Ｐｏｕｌｓｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４（４０），６１９４−６２００（２００５）；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４（２），８７５−８８３（１９９１）；Ｖｏｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２１），１３７０６−１３７１１（１９９１）；Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８（４），７４１−７４２（１９９０）；Ｈｅｌｌｅｒ−Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（２３），９０５３−９０５８（１９８９）；Ａｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７４（１−２），９１−１０１（２００５）；Ｂａｒｒｉｏｓ−Ｒｏｄｉｌｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７（５７１５），１６２１−１６２５（２００５）；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４３３（７０２１），７７−８３（２００５）；Ｂａｌｌｉｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，３（１１），１０９３−１１０１（２００４）；Ｂｅａｕｓｏｌｅｉｌら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ １０１（３３），１２１３０−１２１３５（２００４）；Ｍａｒａｉｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１（１），９７−１０５（１９９２）。ＣＫＩＩのアミノ酸配列または核酸配列との言及には、これらの参考文献のうちの任意のもののアミノ酸配列もしくは核酸配列、およびそれらの対立遺伝子変異体が含まれる。]
[0049] ＩＫＢＫＢおよび関連するＩＫＢＫＡは、ＮＦｋＢ炎症経路のポジティブな調節因子である。ＩＫＢＫＢの配列は、以下の登録番号でＧｅｎｂａｎｋに提供されており：ＮＭ＿００１５５６、そして／または以下のうちの任意の１つの中で見ることができる：Ｃａｔｅｒｉｎｏら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５８０（２８−２９），６５２７−６５３２（２００６）；Ｃａｓｔｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．４（１０），Ｒ６６（２００３）；Ｓａｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６００（１０３），６１−６７（２００２），Ｃａｏｈｕｙ，ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２８），２５２１７−２５２２５（２００２）；Ｙｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１８），１５８１９−１５８２７（２００２）；Ｓｅｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０８（Ｐｔ．ｌ），８５０９５（１９９５）；Ｓｈｉｒｖａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（２２），６８８８−６９０１（１９９４）；Ｃｒｅｕｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８４（１），３４７−３５２（１９９２）；Ｍｅｇｅｎｄｚｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５），３２２８−３２３２（１９９１）；Ｂｕｒｎｓら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ ８６（１０），３７９８−３８０２（１９８９）。ＩＫＢＫＢのアミノ酸配列または核酸配列との言及には、これらの参考文献のうちの任意のもののアミノ酸配列もしくは核酸配列、およびそれらの対立遺伝子変異体が含まれる。]
[0050] シンフィリンは、α−シヌクレインに結合することが示されているシヌクレイン結合タンパク質である。これ自体はキナーゼではないが、シンフィリンは、特にＰＬＫ２との組み合わせにおいて、シヌクレインのリン酸化を促進することが本明細書中で明らかにされた。シンフィリンは、ＰＬＫ２依存性様式でシヌクレインのリン酸化を促進するようであった。シンフィリンの配列は以下の登録番号でＧｅｎｂａｎｋに提供されており：ＮＭ＿００５４６０、そして／または以下のうちの任意の１つの中で見ることができる：Ｔａｎｊｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９（２），５５３−５６５（２００６）；Ｅｙａｌら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ １０３（１５），５９１７−５９２２（２００６）；Ａｖｒａｈａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（５２），４２８７７−４２８８６（２００５）；Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２０（２），４０１−４１１（２００５）；Ｌｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（８），２００２−２００９（２００５）；Ｒｉｂｅｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２６），２３９２７−２３９３３（２００２）；Ｃｈｕｎｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１０），１１４４−１１５０（２００１）；Ｅｎｇｅｌｅｎｄｅｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １１（９），７６３−７６６（２０００）；Ｅｎｇｅｌｅｎｄｅｒら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１），１１０−１１４（１９９９）。シンフィリンのアミノ酸配列または核酸配列との言及には、これらの参考文献のうちの任意のもののアミノ酸配列もしくは核酸配列、およびそれらの対立遺伝子変異体が含まれる。]
[0051] Ｖ．シヌクレインキナーゼの活性または発現を調節する薬剤
１つの態様では、本発明により、本明細書中に記載されるキナーゼの活性または発現を調節する薬剤を投与することによる、ＬＢＤの処置または予防を行う方法が提供される。十分に特性決定された一般的なクラスの多数の薬剤を使用することができる。これらには、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム）、阻害性タンパク質（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）、抗体、および低分子阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。]
[0052] 好ましくは、阻害される遺伝子はＰＬＫ２またはＧＲＫ６である。なぜなら、これらの遺伝子によってコードされるキナーゼは、α−シヌクレイン、特に、ＰＬＫ２を直接リン酸化するからである。ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、およびＧＲＫ７遺伝子もまた、阻害についての好ましい標的である。なぜなら、これらはおそらく、直接のキナーゼ（単数または複数）の間接的な活性化因子をコードするからである。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、およびＧＡＫは、レヴィー小体病における活性化についての好ましい候補である。なぜなら、これらは、α−シヌクレインのリン酸化のネガティブな調節因子をコードするからである。シンフィリン遺伝子が阻害についての好ましい標的である。なぜなら、シンフィリンはキナーゼではないが、（通常は、ＰＬＫ２のようなキナーゼの存在下での）α−シヌクレインのリン酸化の増加と関係があるからである。]
[0053] ＰＬＫ２に対して、１つまたは複数の他のｐｏｌｏ様キナーゼファミリーのメンバー（すなわち、ＰＬＫ１、ＰＬＫ３、およびＰＬＫ４）を上回る特異性を示す阻害剤が好ましい。治療的用途に特に適している阻害剤は、以下の特性のうちの少なくとも１つについて選択することによって同定することができる：
Ｉ．ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ１に対しては効果がないか、または効果が低い。]
[0054] ＩＩ．ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ３に対しては効果がないか、または効果が低い。]
[0055] ＩＩＩ．ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ４に対しては効果がないか、または効果が低い。]
[0056] ＩＶ．ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ１とＰＬＫ３に対しては効果がないか、または効果が低い。]
[0057] Ｖ．ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ１とＰＬＫ４に対しては効果がないか、または効果が低い。]
[0058] ＶＩ．ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ１、ＰＬＫ３、およびＰＬＫ４に対しては効果がないか、または効果が低い。]
[0059] 本発明の状況で使用される場合は、「効果がない」は、薬剤の投与によって発現が低下しないか、または生理学的には有意ではない程度には発現が低下しないことを意味する。「効果が低い」は、ＰＬＫ２の阻害についてのＥＣ５０またはＫｉ値が、参照のＰＬＫ（単数または複数）についてのＥＣ５０よりも低いことを意味する。いくつかの実施形態では、ＥＣ５０は多くとも２分の１であり得、そして時には多くとも１０分の１であり、そして多くとも１００分の１であり、またはさらには多くとも１０００分の１であり得る。]
[0060] 本発明の状況で使用される場合は、ＰＬＫ２「活性」の阻害は、タンパク質の発現を低下させること（例えば、ＰＬＫ２遺伝子の発現を低下させること、ＰＬＫ２ ＲＮＡのプロセシングを妨害すること、ＰＬＫ２ｍＲＮＡもしくはタンパク質の半減期を短くすること）によって、あるいは、ＰＬＫ２キナーゼ活性の競合的または非競合的阻害によって生じ得る。]
[0061] ＰＬＫ２に対して、非ｐｏｌｏキナーゼ（特に、そこに対して薬剤が送達される組織中で発現される他のキナーゼ）を上回る特異性を示す阻害剤が特に好ましい。好ましい実施形態では、これらの薬剤は、ＰＬＫ２と比較して、非ｐｏｌｏキナーゼについて、非ｐｏｌｏキナーゼを阻害しない（または、１０倍高い、時には１００倍高い、そして時には１０００倍高いＥＣ５０値を有する）。しかし、他のキナーゼの阻害は、キナーゼの役割および発現に応じて寛容化され得る。例えば、腸で作用するキナーゼは、脳に送達された阻害剤によっては影響を受けない場合がある。]
[0062] 読者をさらに導くために、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム）、阻害性タンパク質（例えば、亜鉛フィンガータンパク質）、抗体、および低分子阻害剤が以下で説明される。]
[0063] Ａ．阻害性ポリヌクレオチド
標的キナーゼの阻害剤のいくつかの例（ＰＬＫ２を含む）が以下に記載される。ポリヌクレオチド阻害剤は、標的転写物中の特異的な標的配列に結合するように設計される。阻害剤は、ＰＬＫ２ ＲＮＡ中の標的部位に結合し、ＰＬＫ１および／またはＰＬＫ３および／またはＰＬＫ４の中の標的部位には結合しないことが好ましい。適切な標的部位は、他のＰＬＫ中に正確に対応するセグメントを持たないＰＬＫ２のセグメントを選択することによって同定される。好ましくは、ＰＬＫ２の選択されるセグメントには、実質的な配列同一性を持つ対応するセグメントは含まれない（例えば、ＰＬＫ２から選択されるセグメントは、ＰＬＫ４の中の最も対応するセグメントと、９５％未満、９０％、７５％、または５０％の配列同一性しか示さないはずである）。選択された標的セグメントはまた、好ましくは、これが偶然無関係な遺伝子と有意な配列同一性を示さないことを確実にするために、遺伝子のデータベースに対してスクリーニングされる。]
[0064] ＰＬＫ２のポリヌクレオチド阻害剤は、好ましくは、ＰＬＫ２ｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルの少なくとも３０％、５０％、７５％、９５％、または９９％の阻害を示し、これには、ＰＬＫ１および／またはＰＬＫ３および／またはＰＬＫ４のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルに関しては極わずかな低下しか伴わないか、または検出できるほどの低下は伴わない（すなわち、１０％未満、５％、もしくは１％の阻害）。タンパク質の発現は、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して免疫学的分析を行うこと、続いて、抗体とタンパク質との間で形成された複合体の検出を行うことによって定量することができる。ｍＲＮＡレベルは、例えば、ドットブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的逆転写ＰＣＲ（すなわち、いわゆる「ＴａｑＭａｎ」法）、ノーザンブロット、および核酸プローブアレイ法によって定量化することができる。]
[0065] ｉ）短い阻害性ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは比較的短く、少なくとも一部が二本鎖であるＲＮＡ分子である。これは、キナーゼ転写物のような相補性ｍＲＮＡ転写物の発現または翻訳を阻害するように働く。本発明の実施には機構の理解は必要ないが、ｓｉＲＮＡは、相補性ｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することによって作用すると考えられている。ｓｉＲＮＡの設計および使用についての原理は、一般的には、ＷＯ９９／３２６１９，Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．２０，６８７７−６８８８（２００１）、およびＮｙｋａｎｅｎら、Ｃｅｌｌ １０７，３０９−３２１（２００１）；ＷＯ０１／２９０５８によって記載されている。ｓｉＲＮＡは、少なくとも部分的に相補的なＲＮＡの２つの鎖から形成されており、個々の鎖は、好ましくは、１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、または１７ヌクレオチド〜２３ヌクレオチド、または１９ヌクレオチド〜２１ヌクレオチドの長さである。鎖は、それらの長さ全体を通じて互いに完全に相補的である場合があり、また、そうでない場合には二本鎖分子の一方の末端または両方の末端に一本鎖の３’突出を有する場合もある。一本鎖の突出は、存在する場合には、通常は、１塩基〜６塩基であり、１塩基または２塩基が好ましい。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、本発明の遺伝子由来の転写物のセグメントに対して、実質的に相補的である（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、および好ましくは１００％相補的である）ように選択される。ｓｉＲＮＡの鎖の末端に、または末端付近に、任意の適合しない塩基が存在することが好ましい。末端にある適合しない塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり得る。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、目的の遺伝子転写物のセグメントの相補物とアナログの関係を示す。それぞれが１９塩基の完全な相補性を持つ２つの鎖を有しており、そしてセンス鎖の３’末端に２つの適合しない塩基とアンチセンス鎖の３’末端に１つの適合しない塩基を有しているｓｉＲＮＡが特に適している。]
[0066] ｓｉＲＮＡがこのように、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの形態とは異なるように投与される場合は、ｓｉＲＮＡの鎖には１つ以上のヌクレオチドアナログが含まれ得る。ヌクレオチドアナログは、阻害活性が実質的に影響を受けない位置（例えば、５’末端および／または３’末端にある領域、特に、一本鎖突出領域の中）に存在する。好ましいヌクレオチドアナログは、糖が修飾されたリボヌクレオチドまたは骨格が修飾されたリボヌクレオチドである。ヌクレオ塩基が修飾されたリボヌクレオチド（すなわち、自然界に存在するヌクレオ塩基の代わりに自然界には存在しないヌクレオ塩基（例えば、５位が修飾されたウリジンまたはシチジン）（例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン）；８位が修飾されたアデノシンおよびグアノシン（例えば、８−ブロモグアノシン）；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザアデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを含むリボヌクレオチドもまた適している。好ましい糖が修飾されたリボヌクレオチドにおいては、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮ（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである）から選択される基によって置換される。好ましい骨格が修飾されたリボヌクレオチドにおいては、隣接するリボヌクレオチドとの連結を行うホスホエステル基が、修飾された基（例えば、ホスホチオエート基）によって置換される。さらに好ましい修飾は、ｓｉＲＮＡの５’ヒドロキシド残基上にリン酸基を導入するための修飾である。そのような基は、ＡＴＰとＴ４キナーゼでのｓｉＲＮＡの処理によって導入することができる。天然のＲＮＡのホスホジエステル結合もまた、少なくとも１つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含めるために修飾することができる。ＲＮＡ構造の修飾は、ｄｓＲＮＡによって生じる、一部の生命体の中での一般的なパニック反応を回避しつつ、特異的な遺伝子の阻害を可能にするように状況に合わせることができる。同様に、複数の塩基を、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように修飾することができる。]
[0067] そのような薬剤の一例は、ＰＬＫ２に特異的なｓｉＲＮＡである。ＰＬＫ２をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、以下に記載される方法を使用して特異的に設計することができる。ＰＬＫ２についての例示的な登録番号は、表１Ａに提供されるように［ＮＭ＿００６６２２］である。ヒトのＰＬＫ２のアミノ酸配列はまた、配列番号２として示され、そして配列番号１は、このアミノ酸配列をコードする核酸配列である。便宜上、例示的な配列が以下に提供される。]
[0068] ]
[0069] ]
[0070] ｉｉ）ｓｉＲＮＡの設計および生産
阻害性ポリヌクレオチドの利点は、これらを、極めて標的特異性が高くなるように設計できることである。例えば、ＰＬＫ２に特異的なｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ２を他のＰＬＫと区別する標的配列を使用して設計することができる。プログラム「ｓｉＤＥＳＩＧＮ」（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を、任意の核酸配列についてのｓｉＲＮＡを予測するために使用することができ、これは、ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍでワールド・ワイド・ウェブ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ）上で入手することができる。ｓｉＲＮＡを設計するための多数の他のプログラムは、他からも入手することができ、これには、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ−ｂｉｎ／ａｐｐ／ｒｎａｉでＷｅｂ上で入手することができる）が含まれ、また、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／からも入手することができる。ｓｉＲＮＡを設計するための指針は、学術文献（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１，「Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−８．；およびＥｌｂａｓｈｉｒら、２００１，「ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ２１−ａｎｄ ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ」Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００を参照のこと）において入手することができ、また、ウェブ上でも公開されている（例えば「ｒｎａｉｗｅｂ．ｃｏｍ／ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ＿Ｄｅｓｉｇｎ／」および「ｐｒｏｔｏｃｏｌ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｒｕｌｅｓ−ｏｆ−ｓｉＲＮＡ−ｄｅｓｉｇｎ−ｆｏｒ−ＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−−ＲＮＡｉ−３２１０．ｈｔｍｌ」を参照のこと）。]
[0071] ｓｉＲＮＡを生産するためには様々な方法がある。ｓｉＲＮＡは、キナーゼ（例えば、ＰＬＫ２）遺伝子からｓｉＲＮＡを作製するキットを使用して作製することができる。例えば、「Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」キット（カタログ番号Ｔ５１０００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、インビトロで組換え体であるヒト酵素「ダイサー（ｄｉｃｅｒ）」を使用して、長い二本鎖ＲＮＡを２２ｂｐのｓｉＲＮＡに切断する。ｓｉＲＮＡの混合物を生成させることにより、このキットは、標的遺伝子の発現を低下させるであろうｓｉＲＮＡを作製することにおいて高い成功度を可能にする。同様に、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（商標）ｓｉＲＮＡ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）（カタログ番号１６２５、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）はダイサーの代わりにＲＮａｓｅＩＩＩを使用してｄｓＲＮＡからｓｉＲＮＡの混合物を生じさせる。ダイサーと同様に、ＲＮａｓｅＩＩＩはｄｓＲＮＡを２個〜３個のヌクレオチドの３’突出および５’−リン酸と３’−ヒドロキシル末端とを持つ、１２ｂｐ〜３０ｂｐのｄｓＲＮＡ断片に切断する。製造業者によると、ｄｓＲＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成させられ、反応および精製のための成分はキットに含まれている。ｄｓＲＮＡはその後、ＲＮａｓｅＩＩＩによって消化されて、ｓｉＲＮＡの集団を生じる。キットには、インビトロでの転写によって長いｄｓＲＮＡを合成するための試薬、およびそのようなｄｓＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩを使用してｓｉＲＮＡ様分子になるように消化するための試薬が含まれている。製造業者は、ユーザーには、反対向きのＴ７ファージポリメラーゼプロモーターを持つＤＮＡ鋳型、または転写される領域の反対側の末端上にプロモーターを持つ２つの別々の鋳型を供給することだけが求められることを示している。]
[0072] 本発明のｓｉＲＮＡはまた、ベクターから発現させることもできる。典型的には、そのようなベクターは、対応する相補鎖をコードする第２のベクターと共に投与される。一旦、発現させられると、２つの鎖は互いにアニーリングし、機能性の二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。本発明での使用に適している１つの例示的なベクターは、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から入手できるｐＳｕｐｅｒである。いくつかの態様においては、ベクターには、２つのプロモーターが含まれ、一方は第１プロモーターの下流に配置され、かつ逆平行で配置される。第１のプロモーターは一方向に転写され、第２のプロモーターは第１のプロモーターとは逆平行の方向に転写され、それにより、相補鎖の発現が生じる。複数の実施形態のなお別のセットにおいては、プロモーターの後ろに、第１の鎖をコードする第１のセグメント、そして第２の鎖をコードする第２のセグメントが続く。第２の鎖は第１の鎖のパリンドロームに相補的である。第１の鎖と第２の鎖の間に、「ヘアピン」として知られている立体配置で、第２の鎖がぐるりと曲がって第１の鎖とアニーリングすることを可能にするリンカー（「スペーサー」と呼ばれる場合もある）としての役割を果たすＲＮＡの部分がある。]
[0073] リンカー部分の使用を含むヘアピンＲＮＡの形成は当該分野で周知である。典型的には、ｓｉＲＮＡ発現カセットが使用され、ヒトＵ６、マウスＵ６、またはヒトＨ１のようなポリメラーゼＩＩＩプロモーターが用いられる。コード配列は典型的には、短いスペーサーによってその逆相補性アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に連結させられた１９ヌクレオチドのセンスｓｉＲＮＡ配列である。９ヌクレオチドのスペーサーが典型的であるが、他のスペーサーを設計することができる。さらに、５個〜６個のＴ’が、しばしば、ポリメラーゼＩＩＩにとっての終結部位となるようにオリゴヌクレオチドの３’末端に付加される。Ｙｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７（２）：２２８−３６（２００３）；Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ ３１（１５）：ｅ７７（２００３）もまた参照のこと。]
[0074] ｓｉＲＮＡ標的は以下のようなヘアピンｓｉＲＮＡによって標的化され得る。ベクターにより生産される複数の短いヘアピンＲＮＡにより同じ標的を攻撃させる場合には（永久ＲＮＡｉ効果）、間にループを形成する配列を持たせ、さらに、配列の両方の末端に適切な発現ベクターのための適している配列を持たせて、センス鎖とアンチセンス鎖を一列に配置することができる。]
[0075] 本発明のｓｉＲＮＡは、本明細書中に開示されており、当業者に公知である核酸の生成のための任意の適切な方法（例えば、化学合成および組み換え方法）を使用して作製することができる。オリゴヌクレオチドを、所望される特性（例えば、高いヌクレアーゼ耐性、より強い結合、安定性、または所望されるＴｍ）を提供するために、標準的ではない塩基（例えば、アデニン、シチジン、グアニン、およびウリジン以外）または標準的ではない骨格構造を使用して作製できることは明らかであろう。オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にするための技術としては、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６３３に記載されている技術が挙げられる。多種多様な有用な修飾されたオリゴヌクレオチドを生成させることができる。これには、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）骨格を持つオリゴヌクレオチド（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７）、あるいは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホトリエステルヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ホスホルアミデートが取り込まれているオリゴヌクレオチドが含まれる。]
[0076] 例えば、以下が、ＰＬＫ２を阻害するために使用することができるｓｉＲＮＡ配列の例であるが、これらに限定されない。「開始位置」は、登録番号ＮＭ＿００６６２２の配列についていう。]
[0077] 上記ｓｉＲＮＡは、「ｗｗｗ」の後に「ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ＤｅｓｉｇｎＣｅｎｔｅｒ／ＤｅｓｉｇｎＣｅｎｔｅｒＰａｇｅ．ａｓｐｘ」を入力することによって、ｓｉＤＥＳＩＧＮ（登録商標）センターを使用して設計された。それぞれが二本鎖であり、「ＴＴ」突出を持つであろう。]
[0078] さらなる例として、Ａｍｂｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ ｓｉＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）由来のｓｉＲＮＡを、ＰＬＫ２を阻害するために使用することができる。例示的な配列が以下に提供される。個々のｓｉＲＮＡは二本鎖であり、突出として最終的なＴＴ’（両方の末端に存在する）を持つ：]
[0079] ｉｉｉ）アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスポリヌクレオチドは、センスｍＲＮＡに結合して、センスｍＲＮＡの翻訳を妨害すること、転写を妨害すること、ＲＮＡ前駆体のプロセシングもしくは局在化を妨害すること、ｍＲＮＡの転写を抑制すること、あるいは、いくつかの他の機構を通じて作用することによって、抑制を生じることができる（例えば、Ｓａｌｌｅｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４１８，２５２（２００２）を参照のこと）。アンチセンス分子が発現を低下させる特定の機構は重要ではない。典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドには、少なくとも７個〜１０個、典型的には、２０個またはそれ以上のヌクレオチドの一本鎖のアンチセンス配列が含まれる。これらの一本鎖のアンチセンス配列は、本発明のキナーゼ遺伝子のｍＲＮＡに由来する配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは約１０個〜約５０個のヌクレオチドの長さであるか、または約１４個〜約３５個のヌクレオチドの長さである。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、約１００個未満のヌクレオチドまたは約２００個未満のヌクレオチドのポリヌクレオチドである。一般に、このアンチセンスポリヌクレオチドは、安定的な二本鎖を形成するには十分に長いが、しかし、所望される場合には、送達様式に応じて、インビボで投与するために十分に短くあるべきである。標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションに必要なポリヌクレオチドの最小長さは、いくつかの要因、例えば、中でも特に、Ｇ／Ｃ含量、（存在する場合には）不適合塩基の位置、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した配列の独自性の程度、およびポリヌクレオチドの化学的性質（例えばメチルホスホネート骨格、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）に依存する。]
[0080] ｉｖ）リボザイム
リボザイムは、酵素として作用し、そして特定の部位で他のＲＮＡ分子を切断するように操作することができるＲＮＡ分子である。リボザイム自体はこのプロセスでは消費されず、多コピーのｍＲＮＡ標的分子を切断するように触媒的に作用することができる。トランスで標的ＲＮＡを切断するリボザイムの設計についての一般的な原則は、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ＆ Ｇｅｒｌａｃｈ，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１、およびＨｏｌｌｅｎｂｅｃｋ，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５９６−６０３、および米国特許第５，４９６，６９８号に記載されている。リボザイムには、通常は、本発明のキナーゼをコードする遺伝子の転写物上の２つの部位（標的サブサイト）と、隣接する複数のセグメントの間の触媒領域とに相補性を示し、これらに結合する、２つの隣接するセグメントが含まれる。この隣接するセグメントは、通常は５ヌクレオチド〜９ヌクレオチドの長さであり、最適であるのは６ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの長さである。リボザイムの触媒領域は、一般的には、約２２ヌクレオチドの長さである。ｍＲＮＡ標的には、一般式ＮＵＮ、好ましくは、ＧＵＣを持つ、標的サブサイトの間にあるコンセンサスな切断部位が含まれる。（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ａｎｄ Ｓｃａｎｌｏｎ，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：２１３−２２３；Ｐｅｒｒｉｍａｎら、（１９９２）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）１１３：１５７−１６３；Ｒｕｆｆｎｅｒら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１０６９５−１０７０２）；Ｂｉｒｉｋｈら、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４５：１−１６；Ｐｅｒｒｅａｌｔら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：４０２０−４０２５）。リボザイムの特異性は、標的サブサイト、したがって、そのようなサブサイトに相補的であるリボザイムの隣接するセグメントの選択によって制御することができる。リボザイムは、ＲＮＡ分子として、または複製可能なベクターの構成要素としてのリボザイムをコードするＤＮＡの形態で、あるいは、以下に記載されるような複製不可能な形態でのいずれかで、送達することができる。]
[0081] 標的キナーゼ遺伝子の発現はまた、標的遺伝子の調節領域（すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的な配列を有している核酸を送達して、体内の標的細胞中での標的遺伝子の転写を妨げる三重へリックス構造を形成させることによって、低下させることもできる。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，（１９９１），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，６（６）：５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら、（１９９２），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，（１９９２），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−８１５を参照のこと。]
[0082] ｖ）ｓｉＲＮＡおよび他の阻害性核酸の投与
脳は本発明のキナーゼ阻害剤の治療標的である。治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスポリヌクレオチド）は、多数の方法で投与することができる。導入方法としては、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、例えば、任意の便利な経路によって（例えば、輸液によってもしくはボーラス注射によって、上皮内層もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を介する吸収によって）投与することができ、また、他の生物学的に活性な物質と一緒に投与することもできる。一般的には、治療用ポリヌクレオチドは、脳への送達を促進する担体とともに離れた位置に（例えば、ｉ．ｖ．注射によって）投与することができるか、あるいは、脳に直接送達することができる。]
[0083] 脳への直接の投与のためには、ｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡを含む薬学的組成物）を、任意の適切な経路によって投与することができる。これには、脳室内注射および髄膜注射が含まれる。脳室内注射は、（例えば、Ｏｍｍａｙａレザーバーのようなレザーバーに接続されている）脳室内カテーテル、病変部位への直接の注射もしくは潅流、脳の動脈系への注射によって、あるいは、血液−脳関門の化学的または浸透圧による開口によって、容易になり得る。]
[0084] １つのアプローチでは、治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）が、ペプチド結合体として送達される。Ｋｕｍａｒらは、神経系に優先的に感染する神経向性ウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）が脳に浸潤できるという事実を利用した。狂犬病ウイルスは、その脂質エンベロープ上の糖タンパク質を通じてこれを行う。ｓｉＲＮＡを脳の中の神経細胞に移動させるために、Ｋｕｍａｒらは、ニューロンによって発現されたアセチルコリン受容体に選択的に結合する、狂犬病ウイルスの糖タンパク質（ＲＶＧ）エンベロープに由来する２９残基のペプチドを同定した。これらを、ｓｉＲＮＡに結合する９個のアルギニン残基の配列を持つペプチドと融合させた。このペプチドに結合させたｓｉＲＮＡをマウスに静脈内注射した後、彼らは、ペプチドが、脳へのｓｉＲＮＡの経血管送達ができただけでなく、十分な遺伝子のサイレンシングもまたできたことを見出した（Ｋｕｍａｒら、（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３９−４３）。]
[0085] 治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、リポソームと標的化モノクローナル抗体システムを使用して送達することができる。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅは、上皮成長因子に対して惹起させられた、モノクローナル抗体に結合させられた化学修飾されたリポソームが、マウスの脳に浸潤できることを報告した。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡが、ペグ化免疫リポソーム（ＰＩＬ）を用いた静脈内投与によって脳に送達された。プラスミドＤＮＡがリポソームにカプセル化される。これは、ペグ化され、受容体を特異的に標的化するモノクローナル抗体と結合させられる。ＰＩＬを用いた静脈内ＲＮＡｉにより、ヒトの上皮成長因子受容体の９０％のノックダウンが可能である。これにより、頭蓋内に脳のガンを持つマウスの生存期間の９０％の延長が生じた（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，（２００７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５９：１４１−１５２）。]
[0086] 同様に、Ｂｏａｄｏにより、脳にｓｈＲＮＡを送達するための有効な送達システムとしての「Ｔｒｏｊａｎ Ｈｏｒｓｅ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ」（ＴＨＬ）技術の使用が開示されている。ＴＨＬの組織標的特異性は、それぞれ、ＢＢＢおよび脳の細胞膜の両方に存在する特異的な内因性の受容体（すなわち、インシュリンおよびトランスフェリン受容体）に結合するペプチド模倣物であるモノクローナル抗体に対する、リポソーム中のＰＥＧ残基のおよそ１％の結合によってもたらされる。（Ｂｏａｄｏ（２００７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：１７７２−１７８７）。]
[0087] 治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、受容体特異的抗体送達システムおよびアビジン−ビオチン技術の併用によって送達することができる。ｓｉＲＮＡは、標的化モノクローナル抗体とストレプトアビジンとの結合体の生産と同時に、センス鎖のいずれかの末端がモノビオチン化された。ルシフェラーゼ遺伝子で恒久的にトランスフェクトされたラットの膠細胞が、成体ラットの脳に移植された。頭蓋内腫瘍の形成後、ラットは、ビオチン−ストレプトアビジンリンカーによってトランスフェリン受容体抗体に結合させられたビオチン化ｓｉＲＮＡの１回の静脈内注射で処置された。ｓｉＲＮＡの静脈内投与によっては、インビボで脳室内の脳のガンにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の６９％〜８１％の低下が生じた（Ｘｉａら、（２００７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：２３０９−２３１６）。]
[0088] 治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、定位手術または注射によって送達され得る。ＤａｖｉｄｓｏｎとＢｏｕｄｒｅａｕによって、ｓｉＲＮＡを脳神経外科的な定位固定の方法を使用して脳の中に送達することができることが彼らの論文の中でまとめられ、そして特定の遺伝子の転写の減少により、神経疾患の症状が改善したことが示された（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｂｏｕｄｒｅａｕ，（２００７）Ｎｅｕｒｏｎ ５３：７８１−７８８）。]
[0089] Ｘｉａらによって、小脳内注射に注射されると、短いヘアピンＲＮＡを発現する組み換え体アデノ随伴ウイルスベクター（これは、一旦発現されるとｓｉＲＮＡになるようにプロセシングされる）が、運動協調性を改善し、小脳の形態を回復させ、そして１型脊髄小脳失調のマウスのプルキンエ細胞中の特徴的なアタキシン−１封入体を回復させることが報告されている（Ｘｉａら、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：８１６−８２０）。]
[0090] さらに、ＤｉＦｉｇｌｉａらによっては、ヒトのハンチントンｍＲＮＡを標的化する、コレステロールに結合させられたｓｉＲＮＡを線条体内に注射することが報告されている。著者らは、ｓｉＲＮＡの成体マウスの線条体への１回の投与によって遺伝子のサイレンシングが生じ、神経病変が弱毒化され、そしてハンチントン病の迅速に発症するウイルス性のトランスジェニックマウスモデルにおいて観察された異常な行動的表現形が遅らせられたことを見出した（ＤｉＦｉｇｌｉａら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：１７２０４−１７２０９）。そのような方法によっては、注射部位の周囲だけに局在化させられた送達が生じ、これには、脳内での広い作用は伴わないことに留意されたい。]
[0091] Ｓｉｎｇｅｒらによっては、大量のヒトのβ−アミロイドを生産し、そしてその脳にいくつものプラークがある、トランスジェニックマウスの脳細胞にｓｉＲＮＡを送達するために、修飾されたレンチウイルスベクターを使用することが開示されている。彼らは、β−セクレターゼｓｉＲＮＡのレンチウイルスベクターによる送達によって、インビボでは、アミロイド前駆体タンパク質の切断と神経変性が特異的に減少することを見出し、そしてこのアプローチがアルツハイマー病の処置に治療的価値がある可能性があることを示した（Ｓｉｎｇｅｒら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：１３４３−１３４９；Ｏｒｌａｃｃｈｉｏら（２００７）Ｍｉｎｉ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：１ １６６−１１７６にまとめられている）。]
[0092] Ｋｏｕｔｓｉｌｉｅｒｉらによっては、ｓｉＲＮＡの分野の文献がまとめられ、疾患を誘導するｍＲＮＡの対立遺伝子特異的変性を目指す様々なｓｉＲＮＡ標的ストラテジーと、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、および脊髄小脳失調（ＳＣＡ１）を含む神経変性疾患の動物モデルにおけるその適用が開示されている（Ｋｏｕｔｓｉｌｉｅｒｉら（２００７）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．（７２）：４３−４９）。]
[0093] Ｈａｓｓａｎｉらによっては、陽イオン性脂質とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）系ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ）によって、新生マウスの脳へのｓｉＲＮＡの効率的な送達がもたらされ、わずかピコモルレベルのｓｉＲＮＡによって、外因性遺伝子の＞８０％の阻害が生じたことが明らかにされている（Ｈａｓｓａｎｉら（２００５）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．７：１９８−２０７）。]
[0094] Ｋａｔｅｂらは、脳のガンの処置のために脳に薬物を送達するための方法として、ナノテクノロジーを使用した。特に、著者らにより、Ｍｕｌｔｉ−Ｗａｌｌｅｄ Ｃａｒｂｏｎ Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ（ＭＷＣＮＴｓ）の、ｓｉＲＮＡを輸送するためのナノベクターとしての使用が開示されている（Ｋａｔｅｂら（２００７）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ３７ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ９−１７）。]
[0095] 治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、いずれかの治療効果を改善するかまたは高めるために、他の薬剤と組み合わせて使用することができる。このプロセスには、両方の薬剤を含む１つの組成物または薬学的処方物のいずれかとして、両方の薬剤を同時に患者に投与する工程が含まれ得るか、あるいは、２つの異なる組成物または処方物を投与する（この場合、一方の組成物には本発明のｓｉＲＮＡが含まれ、そして他方には第２の薬剤（単数または複数）が含まれる）ことによる。ｓｉＲＮＡ治療にはまた、数分から数週間の範囲の間隔で他の薬剤による処置が先行する場合も、また後に続けられる場合もある。]
[0096] ポリヌクレオチドは、徐放システムを介して送達することができる。一例として、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、前記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。あるいは、ポリマー物質を用いることも可能である（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。さらに別の態様においては、治療標的、すなわち脳の近くに徐放システムを配置することができる。これによると、全身用量のうちのごく少量しか必要としない（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，１９８４：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，第２巻，ｐｐ．１１５−１３８）。他の徐放システムが、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）によってまとめて論じられている。]
[0097] 他のアプローチとしては、例えば、ウイルス送達システムおよび／または非ウイルス送達システムの使用による、様々な輸送システムおよび担体システムの使用を挙げることができる。例えば、ｓｉＲＮＡを、病原性を引き起こすことなく媒体として作用するように修飾されたウイルスの中で、脳に導入することができる。ウイルスは、例えば、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、または神経向性ウイルス（例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス、フラビウイルス、もしくは狂犬病ウイルス）であり得る（Ｌｉら、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：２６１−２７２（２００５）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ５３：７８１−７８８（２００７）；Ｘｉａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １０：８１６−８２０（２００４）；Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３９−４３（２００７）；米国特許第６，３４４，４４５号、同第６，９２４，１４４号、同第６，５２１，４５７号）。さらに、例えば、Ｋａｐｌｉｔｔら、米国特許第６，１８０，６１３号およびＤａｖｉｄｓｏｎ，ＷＯ０４／０１３２８０に記載されているような遺伝子治療アプローチを、脳の中で核酸分子を発現させるために使用することができる。]
[0098] 以下のような様々な非ウイルス送達システムが公知であり、治療用ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を脳に投与するために使用することができる：例えば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、イオントフォレシスによるかまたは他の媒体（例えば、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン）への取り込みによる（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇら、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０３／４７５１８および同ＷＯ０３／４６１８５を参照のこと）、ポリ（乳−コ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡマイクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開番号ＵＳ ２００２１３０４３０を参照のこと）、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性マイクロスフェア、あるいは、タンパク質性のベクターによるか（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／５３７２２）または結合体の使用による。例えば、短いヘアピンＲＮＡをカプセル化している化学修飾されたリポソームは、血液脳関門および脳の細胞膜上に存在する特異的な内因性受容体（例えば、インシュリンおよびトランスフェリン）に特異的なモノクローナル抗体に結合させることができる（Ｂｏａｄｏ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４（９）：１７７２−１７８７（２００７）を参照のこと）。さらなる例として、ｓｉＲＮＡ二本鎖を、受容体特異的抗体送達システムおよびアビジン−ビオチン技術の併用によって送達することができる。ｓｉＲＮＡは、標的化モノクローナル抗体とストレプトアビジンとの結合体の生産と同時に、モノビオチン化させることができる（Ｘｉａら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２４（１２）：２３０９−１６（２００７）を参照のこと）。インビボで血漿膜を横切ってｓｉＲＮＡを送達するための他の方法としては、コレステロールに結合させられたｓｉＲＮＡのような化学修飾されたｓｉＲＮＡが挙げられる（ＤｉＦｉｇｌｉａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０４（４３）：１７２０４−９（２００７）；Ｗｏｌｆｒｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１０）：１１４９−１１５７（２００７）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８（２００３）を参照のこと）。]
[0099] Ｃ．亜鉛フィンガータンパク質
亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、ＰＬＫ２を含む公知の配列のキナーゼ遺伝子の中の任意の所望される標的部位に結合するように操作するか、または選択することができる。これらのタンパク質のうちの１つのクラス（Ｃ２Ｈ２クラス）を特徴づける例示的なモチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−ＨｉＳ（配列番号２１）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）である。１つのフィンガードメインは約３０アミノ酸の長さであり、いくつかの構造試験により、これには、２つの不変のヒスチジン残基と２つの不変のシステイン残基が亜鉛を介して配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）させられたβターンの中に含まれているαへリックスが含まれていることが明らかにされた。いくつかの方法では、標的部位は、プロモーターまたはエンハンサーの中にある。言い換えると、標的部位は構造遺伝子の中にある。いくつかの方法では、亜鉛フィンガータンパク質は、転写リプレッサー（例えば、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢリプレッションドメイン）に連結させられる（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２，３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，４５１４−４５１８（１９９４））。いくつかの方法では、亜鉛フィンガータンパク質は、ＶＩＰ１６のような転写活性化因子に連結させられる。亜鉛フィンガータンパク質はまた、所望される遺伝子の発現を活性化させるためにも使用することができる。亜鉛フィンガータンパク質による標的化に適している標的部位を選択するための方法、および選択された標的部位に結合するように亜鉛フィンガータンパク質を設計するための方法は、ＷＯ００／００３８８に記載されている。ファージディスプレイを使用して標的に結合するように亜鉛フィンガータンパク質を選択するための方法は、ＥＰ．９５９０８６１４．１に記載されている。亜鉛フィンガータンパク質の設計に使用される標的部位は、典型的には、９ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドの程度である。]
[0100] 例えば、細胞膜を横切って所望される核酸を移動させる能力を有しているタンパク質が記載されている。典型的には、そのようなタンパク質は、膜移動担体として作用する能力がある両親媒性または疎水性のサブ配列を持つ。例えば、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切って移動する能力がある。ホメオドメインタンパク質の最も短いインターナライズできるペプチドであるアンテナペディアは、このタンパク質の第３のへリックス（アミノ酸部位４３〜５８位）であることが明らかにされている（例えば、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：６２９−６３４（１９９６）を参照のこと）。別のサブ配列である、シグナルペプチドのｈ（疎水性）ドメインは、同様の細胞膜移動特性を持つことが明らかにされている（例えば、Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５−１４２５８（１９９５）を参照のこと）。そのようなサブ配列を用いて、細胞膜を横切ってオリゴヌクレオチドを移動させることができる。オリゴヌクレオチドは、そのような配列を用いて都合が良いように誘導体化させることができる。例えば、リンカーを用いて、オリゴヌクレオチドと移行配列を連結することができる。例えばペプチドリンカーまたは任意の他の適切な化学的リンカーなど、任意の適切なリンカーを用いることができる。]
[0101] Ｄ．抗体
キナーゼ活性は、本発明のキナーゼに特異的に結合する抗キナーゼ（例えば、抗ＰＬＫ２）抗体（完全な抗体とその結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ）の両方）を投与することによって低下させることができる。通常は、抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた、組み換えによって発現させることができる（例えば、米国特許第６，５５５，３１０号を参照のこと）。発現させることができる抗体の例としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、およびヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体は、その軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子が、通常は、異なる種に属している免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子操作によって構築されている抗体である（例えば、Ｂｏｙｃｅら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：５２０−５３５（２００３）を参照のこと）。例えば、マウスのモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒトの定常（Ｃ）セグメントに連結させることができる。したがって、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶドメインまたは抗原結合ドメインと、ヒト抗体由来のＣドメインまたはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。ヒト化抗体は、ヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基と、マウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）に実質的に由来する相補性決定領域を持つ。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、ならびに、ＷＯ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。定常領域（単数または複数）は、存在する場合には、これもまた、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来するか、またはヒト免疫グロブリンに完全に由来する。抗体は、中でも特に、従来のハイブリドーマアプローチ、ファージディスプレイ（例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、ヒトの免疫系を持つトランスジェニックマウスの使用（Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７（１９９３））によって得ることができる。免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、抗体を生産するハイブリドーマまたは細胞株から、あるいは、公開されている文献の中の免疫グロブリンの核酸配列またはアミノ酸配列に基づいて得ることができる。]
[0102] 抗体は、静脈内注射によって投与することができる。注射された抗体の一部は、血液−脳関門を越えるであろう。あるいは、抗体は、脳に直接（例えば、脳室内注射または髄膜注射）によって直接投与することもできる。抗体は、エンドサイトーシスによってシヌクレインを発現する細胞によってインターナライズされ得る。あるいは、抗体は、細胞膜を横切る輸送を容易にする担体部分に連結させられる場合もある。]
[0103] １つの実施形態では、イントラボディーがＰＬＫ２活性を低下させるために使用される。用語「イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」または「イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」は、細胞内の標的に指向された、細胞内で発現された抗体構築物、通常は、単鎖Ｆｖ抗体をいう。Ｎａｍら、（２００２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ Ｂｉｏｌ．１９３：３０１；ｄｅｒ Ｍａｕｒｒら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｎｏｖ ２２；２７７（４７）：４５０７５；Ｃｏｈｅｎ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７８：３６７。ｓｃＦｖ遺伝子を細胞内に導入することができ、ここでは、ｓｃＦｖタンパク質の発現によってその標的（例えば、ＰＬＫ２）の特性を調節することができ、時には、タンパク質機能が失われ、表現形のノックアウトが生じる。実際、ｓｃＦｖイントラボディーを、細胞質の中で発現させることができ、これを、これが細胞内タンパク質を標的化して特異的な生物学的作用を誘発することができる任意の細胞区画に向けさせることができる。したがって、イントラボディーにより、ＰＬＫ２のようなタンパク質の活性をブロックするかまたは調節するための効果的な手段が提供される。]
[0104] Ｅ．活性を調節するためのキナーゼ阻害剤
上記で議論された生物学的分子に加えて、低分子化合物を、キナーゼの発現または活性を調節する（通常は阻害する）ために使用することができる。以下で議論されるように、既知のキナーゼ阻害剤は、所望される標的特異性および他の特性についてスクリーニングすることができ、そしてさらに別の阻害剤を、標的特異性に基づいて同定することができる。ＰＬＫ２またはＧＲＫ６が、阻害される好ましいキナーゼである。なぜならこれらは、α−シヌクレインを直接リン酸化することについての候補であるからである。ＰＬＫ２が特に好ましいキナーゼである。なぜなら、これは、ＧＲＫ６または本明細書中で試験された他のキナーゼよりもはるかに高いレベルにまでα−シヌクレインをリン酸化することが示されているからである。]
[0105] 他のキナーゼ標的としては、ＡＰＥＧ１、ＣＤＣ７Ｌ１、ＭＥＴ ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ６、ＩＫＢＫＢ、ＣＫＩＩ、およびＧＲＫ７が挙げられ、これらもまた、阻害される好ましいキナーゼである。なぜなら、これらはおそらく、直接のキナーゼ（単数または複数）の間接的な活性化因子であるからである。ＰＲＫＧ１、ＭＡＰＫ１３、およびＧＡＫが、レヴィー小体病における活性化についての好ましいキナーゼである。なぜなら、これらは、α−シヌクレインのリン酸化のネガティブな調節因子であるからである。あるいは、これらのキナーゼ自体、または類似する活性を持つそれらの断片もしくは模倣物を、α−シヌクレインのリン酸化の阻害剤として直接使用することができる。シンフィリンは、α−シヌクレインのリン酸化の阻害のための別の治療標的として使用することができる。例えば、シンフィリンは、α−シヌクレインとＰＬＫ−２の発現、ならびに同定されたシンフィリンの阻害剤を含むアッセイに加えることができる。]
[0106] キナーゼの発現または活性を調節する能力についてスクリーニングされる化合物としては、セクションＩＶに記載される発現の調節因子が挙げられる。これらの化合物にはまた、キナーゼ阻害剤の多くの公知の例が含まれ、これらのうちのいくつかは、治療的用途または臨床試験において、通常は、ガンの処置についてすでに承認されている。リード構造としては、キナゾリン、ピリド［ｄ］−およびピリミドール［ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［ｄ］−ピリミジエン、ピロロ［ｄ］ピリミジン、フェニルアミノ−ピリミジン（ｐｈｅｙｌａｍｉｎｏ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、１−オキソ−３−アリール−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸誘導体、および置換されたインドリン−２−オン、ならびにスタウロスポリンのような天然の産物が挙げられる（Ｔｒａｘｌｅｒら、２００１，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１：４９９−５１２を参照のこと）。そのような化合物のいくつかはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から市販されており、これには、Ｈ８９、Ｙ２７６３２、ＡＴ８７７（塩酸ファスジル）、ロットレリン、ＫＮ６２、Ｕ０１２３、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ワートマニン、Ｌｉ＋、Ｒｏ ３１８２２０、ケレリスレイン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｅｉｎ）、および１０−［３−（ｌ−ピペラジニル）プロピル］−２−トリフルオロメチル−フェノチアジン（Ｄａｖｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５１，９５−１０５（２０００）を参照のこと）が含まれる。現在臨床試験の段階にある他の化合物としては、ＳＴＩ５７１（ＧｌｉｖｅｃＴＭ、フェニルアミノ−ピリミジン誘導体）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＺＤ１８３９（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ））（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ−７７４（Ｒｏｃｈｅ／ＯＳＩ）、ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＩ１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）、ＳＵ５４１６（ＳＵＧＥＮ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２４５８４、アニリン−フタラジン誘導体（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）、ＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ）、ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、およびＣＥＰ２５８３（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）が挙げられる。カベオリン−１は、ＧＲＫキナーゼの活性を調節することが公知である化合物の一例である。ＰＬＫ２／ＳＮＫキナーゼの活性を調節することが公知である化合物の例としては、ｈＶＰＳ１８（ヒトのｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ １８）のＲＩＮＧ−Ｈ２ドメインと、カルシウム−およびインテグリン結合タンパク質ＣＩＢが挙げられる。]
[0107] 特定の実施形態では、治療薬は低分子であり、これは、チアゾリドン、キナゾリン、ピリミジン（例えば、ピリド［ｄ］−ピリミジン、ピリミドール［ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［ｄ］−ピリミジエン、ピロロ［ｄ］ピリミジン、フェニルアミノ−ピリミジン、またはフェニルアミノ−ピリミジン誘導体）；インダゾール−ピリジン誘導体、カルボン酸誘導体（例えば、１−オキソ−３−アリール−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸誘導体）、置換されたインドリン−２−オン、アニリン−フタラジン誘導体；キノリノン誘導体、ベンズチアゾール−３オキサイド化合物、アザインダゾール化合物、またはジヒドロプテリジノンである。特定の実施形態では、治療薬は、ＵＳ ２００７０２０３１４３；ＵＳ ２００７／０１７９１７７；ＵＳ ２００７／０１３５３８７；ＵＳ ２００７／００１０５６５；ＵＳ ２００７／００３７８６２；ＵＳ ２００７／００１０５６６；ＵＳ ２００６／００７４１１９；ＵＳ ２００６／００７９５０３；ＵＳ ２００６／０２２３８３３；ＵＳ ２００５／００１４７６１；ＵＳ ２００４／０１７６３８０；ＵＳ ２００６／００４０９９７；ＵＳ ６，８６１，４２２；ＵＳ ２００５／００１４７６０；ＵＳ ２００６／００２５４１１；ＵＳ ２００４／０１７６３８０；ＵＳ ２００５／００１４７６１；ＵＳ ２００７／０２０３１４３；ＵＳ ２００７／００７２８３３；ＵＳ ２００７／０１３５３８７、またはＷＯ０３０８７０９５に記載されている、低分子プロテインキナーゼ阻害剤である。上記刊行物はそれぞれが参考として本明細書に援用される。]
[0108] 化合物は合成のものである場合も、また、例えば、海洋性微生物、藻類、植物、および真菌のような天然の供給源から得ることもできる。試験することができる他の化合物としては、α−シヌクレインと相互作用することが公知である化合物（例えば、シンフィリン）が挙げられる。あるいは、化合物は、ペプチドまたは低分子を含む薬剤のコンビナトリアルライブラリー由来のものであっても、また、産業的に（例えば、化学工業によって、製薬産業によって、環境産業によって、農業によって、漁業によって、化粧品産業によって、医薬品業界によって、およびバイオテクノロジー産業によって）合成された化合物の既存のレパートリーに由来するものであってもよい。コンビナトリアルライブラリーは、段階的様式で合成することができる多くのタイプの化合物について生成させることができる。そのような化合物としては、ポリペプチド、タンパク質、核酸、β−ターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシンおよびオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを、Ａｆｆｙｍａｘ ＷＯ９５／１２６０８、Ａｆｆｙｍａｘ ＷＯ９３／０６１２１、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＷＯ９４／０８０５１、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ＷＯ９５／３５５０３、およびＳｃｒｉｐｐｓ ＷＯ９５／３０６４２（これらのそれぞれが、全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書に援用される）に記載されているコードされる合成ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＥＳＬ）法によって構築することができる。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法によっても作製することができる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ，ＷＯ９１／１８９８０を参照のこと。スクリーニングされる化合物はまた、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ（ＮＣＩ）Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｔｈｅ ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＮＣＩ’ｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍなどを含む行政機関である供給源または個人的な供給源からも得ることができる。化合物としては、例えば、医薬品、治療薬、環境因子、農業的な因子、または産業的な因子、汚染物質、薬用化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖類、炭水化物、およびキメラ分子を挙げることができる。]
[0109] 上記で議論されるように、ＰＬＫ２を優先的に阻害するキナーゼ阻害剤は特に有用である。以下の実施例１３〜１６に示されるように、本発明者らは、ラットの腹側中脳およびマウスの皮質細胞培養物、ならびに他の細胞中でのα−シヌクレインのリン酸化のレベルについて、いくつかのキナーゼ阻害剤の影響をアッセイした。]
[0110] 本発明にしたがって使用される例示的な化合物は、以下の構造を有している化合物ＢＩ２５３６である：]
[0111] 以下の実施例で明らかにされるように、ＢＩ２５３６（４−［［（７ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−５−メチル−６−オキソ−２−プテリジニル］アミノ］−３−メトキシ−ｎ−（１−メチル−４−ピペリジニル）−ベンズアミド；ＥＬＮ−４８１５７４−２とも呼ばれる）は、様々な細胞のタイプの中でα−シヌクレインのリン酸化を減少させた。ＢＩ２５３６は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、およびＰＬＫ３を阻害し（Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒら、２００７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：３１６−３２２を参照のこと）、そしてＰＬＫ４は阻害しない（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：９５５１−９５６３）。Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒらによって、ＰＬＫ１については０．８３ｎＭのＩＣ５０、ＰＬＫ２については３．５ｎＭ、そしてＰＬＫ３については９ｎＭのＩＣ５０が報告されている。以下の実施例１５に記載される試験では、ＢＩ２５３６が、ＰＬＫ２（ＩＣ５０ １１ｎＭ）については１６倍の選択性、そしてＰＬＫ３（ＩＣ５０ １４ｎＭ）については１３倍の選択性があることが示された。ＢＩ２５３６は、カテゴリーＩＶ ＰＬＫ２特異性（ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ４に対しては効果がないか、または効果が低い）を有しており、そしてパーキンソン病の治療薬の候補である。]
[0112] したがって、１つの態様では、本発明により、α−シヌクレインのリン酸化が減少するように、細胞を、細胞中のＰＬＫ２活性を低下させる量のＢＩ２５３６と接触させることにより、哺乳動物細胞中でのα−シヌクレインのリン酸化を阻害するための方法が提供される。関連する態様では、本発明により、治療有効量のＢＩ２５３６を投与することによる、パーキンソン病と診断された患者を処置する方法が提供される。]
[0113] 米国特許第６，８６１，４２２号（参考として本明細書に援用される）には、ＢＩ２５３６と、構造的に関係があるジヒドロプテリジノンキナーゼ阻害剤が記載されている。ＰＬＫ２を阻害するジヒドロプテリジノン化合物は、シヌクレインのリン酸化の阻害に有用である。]
[0114] 本発明にしたがって使用される別の例示的な化合物は、以下の構造を有している化合物ＥＬＮ−４８１０８０である：]
[0115] ＭｃＩｎｎｅｓら、２００６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：１８１−９７（化合物８）を参照のこと。参考として本明細書に援用されるＵＳ ２００６／００４０９９７，「Ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ−３ ｏｘｉｄｅｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」もまた参照のこと。以下の実施例１４を参照のこと。]
[0116] ｐｏｌｏ様キナーゼのいくつかの阻害剤が、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００７，「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：９５５１−６３に記載されている。その実験で特性決定されたもののうちのいくつかが、ＰＬＫ２を優先的に阻害し、これらを治療薬として使用することができる。]
[0117] 例えば、ＣＨＩＲ−２５８（３）は、ｔ（４；１４）多発性骨髄腫の処置のために開発された複数標的成長因子キナーゼ阻害剤である（Ｔｒｕｄｅｌら、２００５，Ｂｌｏｏｄ．ｌ０５：２９４１−８）。]
[0118] ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、およびＰＬＫ４に対するＣＨＩＲ−２５８のＫｉ値は、それぞれ、＞２０ｕＭ、０．８５ｕＭ、＞２０ｕＭ、および１．４ｕＭであり、これらは、ＣＨＲ−２５８がＶＩ型阻害剤である（ＰＬＫ２活性を阻害し、そしてＰＬＫ１、ＰＬＫ３、およびＰＬＫ４に対しては効果が低い）ことを意味している。ＣＨＩＲ−２５８は受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるが、この化合物がパーキンソン病の処置および予防について許容される治療指数と、臨床的に許容される副作用のプロフィールを有しているかどうかを決定するために、副作用のプロフィールの認可試験、脳への標的化された送達、および／または特定の処置レジュメを調べることができる。ＣＨＩＲ−２５８および関連するキノリノン誘導体は、参考として本明細書に援用されるＷＯ０３０８７０９５に記載されている。]
[0119] スニチニブ（ＳＵ１１２４８）（４）は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００７の実験に基づくと、ＩＶ型阻害剤の一例である（ＰＬＫ２活性を阻害し、ＰＬＫ１またはＰＬＫ３に対しては効果が低い）。スニチニブは、難治性であるかまたはイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）に対して不耐性である進行した腎細胞ガンおよび消化管間葉系腫瘍の処置について承認されている、ＦＬＴ３受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の阻害剤として同定された。Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら、２００３，Ｂｌｏｏｄ １０１：３５９７−６０５。]
[0120] ５−（５，６−ジメトキシ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル）−３−｛［２−（トリフルオロメチル）−ベンジル］オキシ｝チオフェン−２−カルボキサミド（５）は、ＩＩＩ型の薬剤の一例である（ＰＬＫ２活性を阻害し、ＰＬＫ４に対しては効果が低い）。この化合物は、新生物の処置のためのＰＬＫ１およびＰＬＫ３の選択的チオフェンベンズイミダゾールＡＴＰ競合阻害剤として最初に同定された。Ｌａｎｓｉｎｇら、２００７，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６：４５０−９。ＰＬＫの他の阻害剤が記載されている、参考として本明細書に援用されるＵＳ ２００６００７４１１９もまた参照のこと。]
[0121] 化合物６と化合物７は、抗腫瘍薬として提案されているプロテインキナーゼＢ／Ａｋｔの、インダゾール−ピリジンをベースとする阻害剤である（Ｗｏｏｄｓら、２００６，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１４：６８３２−４６を参照のこと）。それぞれが、ＰＬＫ１またはＰＬＫ３についてのＫｉよりも、ＰＬＫ２について低いＫｉを持ち（ＩＶ型阻害剤）、そしてパーキンソン病の処置のために使用することができる。]
[0122] いくつかの実施形態では、薬剤は、自然界に存在している薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、４０００未満の分子量を持ち、多くの場合は３０００未満、多くの場合は２０００未満、通常は１０００未満、そして多くの場合には５００未満の分子量を持つ。]
[0123] 特定の実施形態では、治療薬は、チアゾリドン以外の低分子である。特定の実施形態では、治療薬はＸ以外の低分子であり、ここでは、Ｘは、以下のうちの１つであるか、あるいは以下の１つ以上から別々に選択される：（ｉ）チアゾリドン、（ｉｉ）キナゾリン、（ｉｉｉ）ピリミジン、（ｉｖ）ピリド［ｄ］−ピリミジン、（ｖ）ピリミドール［ｄ］ピリミジン、（ｖｉ）ピラゾロ［ｄ］−ピリミジエン、（ｖｉｉ）ピロロ［ｄ］ピリミジン、（ｖｉｉｉ）フェニルアミノ−ピリミジン、（ｉｘ）フェニルアミノ−ピリミジン誘導体、（ｘ）インダゾール−ピリジン誘導体、（ｘｉ）カルボン酸誘導体、（ｘｉｉ）１−オキソ−３−アリール−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸誘導体、（ｘｉｉｉ）置換されたインドリン−２−オン、（ｘｉｖ）アニリン−フタラジン誘導体；（ｘｖ）キノリノン誘導体、（ｘｖｉ）チアゾリジノン化合物、（ｘｖｉｉ）ベンズチアゾール−３オキサイド、（ｘｖｉｉｉ）ジヒドロプテリジノン、または（ｘｉｘ）アザインダゾール化合物。]
[0124] 特定の実施形態では、治療薬はＵＳ ２００７／０１７９１７７に記載されている化合物ではないという条件で、低分子である。特定の実施形態では、治療薬は、ＵＳ ２００７／００１０５６５に記載されている化合物ではないという条件で、低分子である。特定の実施形態では、治療薬は、ＵＳ ２００７／００３７８６２に記載されている化合物ではないという条件で、低分子である。特定の実施形態では、治療薬は、２００７／００１０５６６に記載されている化合物ではないという条件で、低分子である。特定の実施形態では、治療薬は、２００６／００７９５０３に記載されている化合物ではないという条件で、低分子である。特定の実施形態では、治療薬は、ＵＳ ２００６／０２２３８３３に記載されている化合物ではないという条件で、低分子である。上記刊行物はそれぞれ、参考として本明細書に援用される。]
[0125] ＶＩ．処置方法
本発明により、レヴィー小体病を、そのような疾患に罹患しているかまたはそのような疾患のリスクがある患者において、予防または処置するいくつかの方法が提供される。治療薬には、α−シヌクレインのリン酸化を阻害する、および／またはα−シヌクレインの全レベルを低下させる上記薬剤のうちの任意のものが含まれる。]
[0126] 以下の実施例では、ＰＬＫ２がシヌクレインキナーゼであることの強い証拠が提供される。したがって、特定の態様では、本発明により、ＬＢ疾患の処置または予防を行う方法が提供される。この方法は、この疾患に罹患しているかまたはこの疾患のリスクがある患者に対して、ＰＬＫ２の活性または発現を抑制するために有効な薬剤の有効なレジュメを投与することによる。薬剤が、ＰＬＫ２に対して高いレベルの特異性を示すことが好ましい。]
[0127] 処置に反応しやすい患者としては、ＬＢＤの疾患のリスクがあるが、症状を示していない個体、ならびに、現在症状を示している患者が挙げられる。したがって、本発明の方法は、ＬＢＤについて遺伝的リスクがあることが明らかである個体に対して予防的に投与することができる。そのような個体としては、この疾患を経験した血縁者がいる個体、および遺伝的マーカーまたは生化学的マーカーについての分析によってそのリスクがあることが決定された個体が挙げられる。ＰＤのリスクについての遺伝的マーカーとしては、α−シヌクレイン、またはＰａｒｋｉｎ、ＵＣＨＬＩ、ＬＲＲＫ２、およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の中での突然変異、特に、α−シヌクレイン遺伝子の３０位および５３位での突然変異が挙げられる。ＰＤのリスクについての別の遺伝的マーカーとしては、レベル、またはＳＮＣＡ用量、または転写を測定することが含まれる。現在パーキンソン病に罹患している個体は、静止時振戦、筋硬直、運動緩徐、および姿勢の不安定を含む、その臨床的な発現によって認定することができる。]
[0128] いくつかの方法では、患者には、レヴィー小体を特徴とする疾患以外の任意のアミロイドーシス疾患についての臨床症状がないか、またはそのリスク因子がない。いくつかの方法では、患者は、細胞外アミロイド沈着を特徴とする任意の疾患についての臨床症状またはリスク因子がない。]
[0129] いくつかの方法では、患者は、ガンおよび／またはアルツハイマー病と診断されていない。]
[0130] 処置には、典型的には、長期にわたる複数回の投与が必然的に伴う。処置は、処置されている疾患の徴候または症状を、処置の開始前のベースラインの測定値と比較してアッセイすることによってモニターすることができる。いくつかの方法では、薬剤の投与によって、凝集したα−シヌクレインの細胞内レベルの低下が生じる。いくつかの方法では、薬剤の投与により、リン酸化されたシヌクレインのレベルの低下が生じる。いくつかの方法では、薬剤の投与により、ＬＢＤの臨床症状（例えば、パーキンソン病の場合には、運動機能または認識機能）の改善が生じる。]
[0131] 予防的な用途においては、薬学的組成物または医薬品は、疾患（その疾患の生理学的症状、生化学的症状、組織学的症状、および／または行動的症状、その合併症、ならびに、その疾患の発症の際に現れる介在する病理学的表現形を含む）のリスクをなくすかもしくは下げる、重篤度を低下させる、または発症を遅らせるために十分な、組成物または医薬品の投与量および投与頻度を含むレジュメにおいて、ＬＢＤに罹患しやすいかまたは別の意味でＬＢＤのリスクがある患者に投与される。治療的な用途においては、組成物または医薬品は、その合併症とその疾患の発症の際に介在する病理学的表現形を含む疾患の症状（生理学的症状、生化学的症状、組織学的症状、および／または行動的症状）を治癒させるか、あるいは少なくとも部分的に停止させるために十分な、組成物の投与量および投与頻度を含むレジュメにおいて、そのような疾患に罹患していることが疑われるかまたはそのような疾患にすでに罹患している患者に投与される。治療的または予防的処置を行うために適している量は、治療有効量または予防有効量として定義される。治療的処置または予防的処置を行うために適している量と投与頻度の組み合わせは、治療的に有効なレジュメまたは予防的に有効なレジュメとして定義される。]
[0132] 上記の症状の処置についての本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与されている他の医薬品、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの様々な要因に依存して変化する。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物もまた処置することができる。投与量は、安全性および効力を最適化するために滴定される必要がある。]
[0133] 投与量と投与頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変わり得る。指針は、他の適応症について現在承認されているか、臨床試験の段階にある、キナーゼ阻害剤の投与スケジュールから得ることができる。０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、１０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投与量が使用され得る。投与頻度（例えば、１日１回、１週間に１回、または１カ月に１回）は、薬物の半減期に依存する。予防的用途においては、比較的低用量が、長期にわたり比較的低頻度で間隔をあけて投与される。一部の患者には、彼らの生涯の残りの期間を通じて、処置が投与され続ける。治療的用途においては、時には、比較的短い間隔での比較的高用量が、疾患の進行が低下するか終わるまで、好ましくは、患者がその疾患の症状の部分的もしくは完全な軽減を示すまで、必要である。その後、患者には、予防的レジュメを投与することができる。]
[0134] 治療薬は、予防的および／または治療的処置のために、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻内、または筋肉内での手段によって投与することができる。いくつかの方法では、薬剤は、沈着物が蓄積する特定の組織に直接注入（例えば、頭蓋内注射）される。いくつかの方法では、薬剤は、徐放組成物、またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）デバイスのようなデバイスとして投与される。血液脳関門を十分に通過する低分子は、通常は、経口投与されるが、これはまた、静脈内投与することもできる。]
[0135] 本発明の薬剤は、状況に応じて、ＬＢＤの処置に少なくとも部分的に有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明の薬剤はまた、血液−脳関門を越える本発明の薬剤の移動を増大させる他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。]

权利要求:

請求項1
α−シヌクレインを発現する哺乳動物細胞においてα−シヌクレインのリン酸化を減少させる薬剤を同定する方法であって：ａ）ＰＬＫ２を発現する細胞中でのＰＬＫ２の活性を低下させる；およびｂ）ＰＬＫ１を発現する細胞中でのＰＬＫ１の活性を低下させないか、もしくはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ１の活性を低下させる；および／または、ｃ）ＰＬＫ３を発現する細胞中でのＰＬＫ３の活性を低下させないか、もしくはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ３の活性を低下させる；および／またはｄ）ＰＬＫ４を発現する細胞中でのＰＬＫ４の活性を低下させないか、もしくはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ４の活性を低下させる薬剤を選択する工程を含む、方法。
請求項2
前記細胞がα−シヌクレインを過剰発現する哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
請求項3
ａ）ＰＬＫ２を発現する細胞中でのＰＬＫ２の活性を低下させる；ｂ）ＰＬＫ１を発現する細胞中でのＰＬＫ１の活性を低下させないか、もしくはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ１の活性を低下させる；ｃ）ＰＬＫ３を発現する細胞中でのＰＬＫ３の活性を低下させないか、もしくはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ３の活性を低下させる；およびｄ）ＰＬＫ４を発現する細胞中でのＰＬＫ４の活性を低下させないか、もしくはＰＬＫ２についてのＥＣ５０よりも高いＥＣ５０でＰＬＫ４の活性を低下させる薬剤を選択する工程を含む、請求項１に記載の方法。
請求項4
シンフィリンの存在下でＰＬＫ２を調節する薬剤を同定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
請求項5
パーキンソン病の処置のための薬剤を同定する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法にしたがって薬剤を選択する工程を含み、該選択した薬剤が、その疾患の動物モデルにおいてレヴィー小体病の処置に有用な活性を示すかどうかを決定する工程をさらに含む、方法。
請求項6
パーキンソン病の処置のための薬剤を同定する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法にしたがって薬剤を選択する工程を含み、該選択した薬剤が、その疾患の細胞モデルにおいてレヴィー小体病の処置に有用な活性を示すかどうかを決定するさらに工程を含む、方法。
請求項7
前記疾患の細胞モデルが、神経系統に由来する細胞培養物である、請求項６に記載の方法。
請求項8
前記疾患の細胞モデルが、α−シヌクレインを過剰発現する哺乳動物細胞である、請求項７に記載の方法。
請求項9
前記活性が、セリン−１２９でリン酸化された全α−シヌクレインの割合の低下である、請求項７に記載の方法。
請求項10
前記活性が、前記細胞中のα−シヌクレインの凝集の減少である、請求項７に記載の方法。
請求項11
哺乳動物細胞中でのα−シヌクレインのリン酸化を阻害するための方法であって、α−シヌクレインのリン酸化が減少するように、該細胞を、該細胞中のｐｏｌｏ様キナーゼ２（ＰＬＫ２）の活性を低下させる薬剤と接触させる工程を含み、ここでは、該薬剤は、存在する場合にはＰＬＫ１活性、ＰＬＫ２活性、またはＰＬＫ３活性の低下と比較して、ＰＬＫ２活性を優先的に低下させる、方法。
請求項12
前記薬剤が前記ＰＬＫ２タンパク質の発現を低下させる、請求項１１に記載の方法。
請求項13
前記細胞が神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌ）である、請求項１１に記載の方法。
請求項14
前記薬剤が合成化合物である、請求項１１に記載の方法。
請求項15
前記薬剤が４０００未満の分子量を持つ、請求項１４に記載の方法。
請求項16
前記薬剤が、ＰＬＫ２ＲＮＡ転写物の発現または翻訳を阻害するポリヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
請求項17
前記薬剤が、二本鎖領域を含むｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
請求項18
前記二本鎖領域の一方の鎖がＰＬＫ２転写物に完全に相補的であり、ＰＬＫ１転写物またはＰＬＫ３転写物に対する完全な相補性は持たない、請求項１７に記載の方法。
請求項19
シヌクレインのリン酸化が減少するように、細胞中のｐｏｌｏ様キナーゼ２（ＰＬＫ２）活性を低下させる工程を含む、哺乳動物細胞中でのα−シヌクレインのリン酸化を阻害するための方法。
請求項20
ＰＬＫ２活性を阻害する薬剤の治療有効量を投与する工程を含む、パーキンソン病と診断された患者を処置する方法。
請求項21
前記薬剤が、ＰＬＫ１活性またはＰＬＫ３活性の阻害と比較して、ＰＬＫ２活性を優先的に阻害する、請求項２０に記載の方法。
請求項22
前記薬剤が、ＰＬＫ１活性およびＰＬＫ３活性の両方の阻害と比較して、ＰＬＫ２活性を優先的に阻害する、請求項１１に記載の方法。
請求項23
前記薬剤がｓｉＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
請求項24
前記薬剤が、二本鎖領域を含むｓｉＲＮＡである、請求項２３に記載の方法。
請求項25
前記二本鎖領域の一方の鎖がＰＬＫ２転写物に完全に相補的であり、ＰＬＫ１転写物またはＰＬＫ３転写物に対する完全な相補性は持たない、請求項２４に記載の方法。
請求項26
前記薬剤が、４０００未満の分子量を持つ合成化合物である、請求項２０に記載の方法。
請求項27
前記患者が、ガンと診断されていないかまたはガンの処置を受けていない、請求項２０に記載の方法。
請求項28
前記患者が、アルツハイマー病と診断されていないかまたはアルツハイマー病の処置を受けていない、請求項２０に記載の方法。